miR-134調(diào)控人肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥*

俞萬鈞，汪一萍，李紀(jì)鵬，王華英△(寧波市鄞州人民醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，檢驗(yàn)科，浙江寧波35040)

miR-134調(diào)控人肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥*

俞萬鈞1，汪一萍2，李紀(jì)鵬2，王華英1△
(寧波市鄞州人民醫(yī)院1呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，2檢驗(yàn)科，浙江寧波315040)

［摘要］目的:探討微小RNA-134( miR-134)在人肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制。方法:采用miRNA芯片篩選A549/CDDP和A549細(xì)胞差異表達(dá)miRNA，應(yīng)用real-time PCR驗(yàn)證miR-134的表達(dá)。將miR-134模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染A549/CDDP和A549細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Western blot技術(shù)檢測(cè)miR-134對(duì)叉頭框蛋白M1( FOXM1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白1( MRP1)表達(dá)的影響。結(jié)果: miRNA芯片顯示，13 種miRNAs在A549/CDDP和A549細(xì)胞中呈顯著表達(dá);其中，miR-134下調(diào)最顯著。miR-134模擬物轉(zhuǎn)染組A549/ CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較陰性對(duì)照組顯著提高( P＜0. 01)，而miR-134抑制物轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較陰性對(duì)照組顯著降低( P＜0. 01)。FOXM1 siRNA能夠有效抑制FOXM1蛋白表達(dá)，si-FOXM1轉(zhuǎn)染組A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較陰性對(duì)照組顯著提高( P＜0. 01)。此外，Western blot結(jié)果顯示miR-134能夠抑制MRP1蛋白表達(dá)。結(jié)論: miR-134能夠增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其機(jī)制可能與調(diào)控FOXM1和MRP1表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］微小RNA-134;肺腺癌;順鉑耐藥;叉頭框蛋白M1;多藥耐藥相關(guān)蛋白1

微小RNA( microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子RNA，普遍存在于原核和真核生物中。越來越多的研究表明miRNA與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥密切相關(guān)［1-3］。miR-134基因定位于14q32，發(fā)揮抑癌基因功能，多在腫瘤中表達(dá)下調(diào)［4-6］。但是miR-134在腫瘤細(xì)胞化療耐藥中的作用及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究中，我們通過miRNA芯片篩選了肺癌順鉑( cisplatin，CDDP)耐藥細(xì)胞A549/CDDP和A549親本細(xì)胞間的表達(dá)差異，并對(duì)差異表達(dá)的miR-134在肺癌順鉑耐藥中的作用及機(jī)制進(jìn)行了探討，以期為臨床個(gè)體化治療肺腺癌提供有價(jià)值的化療耐藥分子標(biāo)記物，并為逆轉(zhuǎn)其化療耐藥尋找新的分子治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1細(xì)胞和主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和順鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP均為本室保存。

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品; Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品; miR-134模擬物( miR-134)及其陰性對(duì)照( negative control，NC)、miR-134抑制物( anti-miR-134)及其陰性對(duì)照( anti-NC)和叉頭框蛋白M1( forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1)干擾RNA( si-FOXM1)均為上海吉瑪公司產(chǎn)品;順鉑和MTT試劑為Sigma產(chǎn)品; FOXM1、多藥耐藥相關(guān)蛋白1 ( multidrug-associated protein 1，MRP1)和β-actin抗體為Santa Cruz產(chǎn)品; TaqMan miRNA分析試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀為ABI產(chǎn)品。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L 的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，A549/CDDP細(xì)胞系另加終濃度為40 μmol/L的順鉑以維持其耐藥性。2種細(xì)胞均于37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1 d，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，均勻鋪于細(xì)胞板。12～16 h后時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

2.2基因芯片篩選A549/CDDP和A549細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，并用1. 5%凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，確定A260/A280值在1. 8～2. 1之間并且完整性好的總RNA交由杭州聯(lián)川生物公司進(jìn)行miRNA芯片分析。

2.3RNA提取和real-time PCR采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒分析miR-134的表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞，接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞。分別轉(zhuǎn)染anti-NC、anti-miR-134、NC和miR-134，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染24 h后分別加入不同終濃度的順鉑。藥物共培養(yǎng)48 h后，每孔加入2 g/L的MTT 50 μL，置37℃、5% CO2溫箱中4 h，翻板棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，置37℃、5% CO2溫箱中30 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度( A)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度( IC50)。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平收集細(xì)胞，運(yùn)用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃封閉2 h。分別加入FOXM1和MRP1單克隆抗體，在4℃下孵育過夜。1×TBST緩沖液洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，置于37℃孵育2 h。1×BST緩沖液洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 miRNA在A549/CDDP和A549細(xì)胞間的表達(dá)差異

利用高通量miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549/CDDP細(xì)胞中有13條miRNAs與A549親本細(xì)胞呈顯著差異，其中7種miRNA(包括miR-134、miR-200b、miR-495、miR-379、miR-194、miR-376a和miR-127)在A549/CDDP中表達(dá)下調(diào)，6種miRNA(包括miR-125a、miR-324、miR-100、miR-99a和miR-27a)表達(dá)上調(diào)，見表1。應(yīng)用realtime PCR的方法對(duì)芯片中下調(diào)最顯著的miR-134進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-134在A549/CDDP細(xì)胞中下調(diào)了( 15.40±0.56)倍( P＜0.01)，提示miR-134可能與肺腺癌順鉑耐藥相關(guān)。

表1　在A549/CDDP和A549細(xì)胞系中差異表達(dá)的miRNATable 1.miRNAs differentially expressed in A549/CDDP and A549 cell lines ( Mean±SD.n =3)

2 miR-134的表達(dá)影響肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

A549/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134模擬物后其對(duì)順鉑的半數(shù)抑制量較陰性對(duì)照組顯著下降( P＜0. 01)。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134抑制物后其對(duì)順鉑的半數(shù)抑制量較陰性對(duì)照組顯著增高( P＜0. 01)，見圖1。

Figure 1.Effects of miR-134 on A549/CDDP and A549 cells sensitivity to cisplatin.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs anti-NC.圖1　miR-134對(duì)A549/CDDP和A549細(xì)胞順鉑敏感性的影響

3 miR-134抑制FOXM1蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1在A549/CDDP中表達(dá)顯著升高，轉(zhuǎn)染miR-134模擬物后FOXM1表達(dá)受到抑制，而在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134抑制物后FOXM1蛋白的表達(dá)升高，見圖2。

Figure 2.miR-134 regulated FOXM1 protein expression.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs A549;##P＜0. 01 vs NC;△△P＜0. 01 vs anti-NC.圖2　miR-134調(diào)控FOXM1蛋白表達(dá)

4 FOXM1基因沉默影響肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

FOXM1 siRNA轉(zhuǎn)染A549/CDDP后FOXM1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制量較陰性對(duì)照組顯著下降( P＜0. 01)，見圖3。

5 miR-134抑制MRP1的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，A549/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134模擬物后MRP1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，而在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134抑制物后MRP1蛋白的表達(dá)升高，見圖4。

Figure 3.FOXM1 knockdown increased sensitivity of A549/ CDDP cells to cisplatin.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs NC.圖3　FOXM1基因沉默增加A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

Figure 4.miR-134 suppressed MRP1 protein expression.Mean ±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs anti-NC.圖4　miR-134抑制MRP1蛋白表達(dá)

討論

miRNA主要是通過抑制靶基因的翻譯或介導(dǎo)靶基因mRNA的降解在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中發(fā)揮作用。隨著對(duì)miRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的不斷深入，miRNA在肺癌中的作用及機(jī)制已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Raponi等［7］發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌病人的生存期有顯著相關(guān)性，是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷的一個(gè)重要的miRNA因子。Fei等［8］報(bào)道m(xù)iR-21、miR-181a和miR-16在肺癌細(xì)胞A549的增殖過程中發(fā)揮著聯(lián)合作用，利用反義核酸技術(shù)抑制3種miRNAs的表達(dá)可以通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)生和細(xì)胞周期阻滯從而顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。另外，Zhang等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-513a-3p在肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)能增加腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，提示miRNA是一個(gè)有前途的腫瘤治療藥物，但miRNA在肺癌化療耐藥中的作用及機(jī)制仍不完全清楚。因此，深入研究miRNA在肺癌耐藥中的分子機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥尋找新的分子治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。

本研究中，我們利用高通量miRNA芯片技術(shù)對(duì)A549/CDDP細(xì)胞與A549親本細(xì)胞之間miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其中有13條miRNAs呈顯著差異表達(dá)，其中miR-134在A549/CDDP中表達(dá)水平顯著下調(diào)了( 15. 40±0. 56)倍，提示miR-134可能與肺癌的化療耐藥相關(guān)。已有的研究顯示miR-134在腫瘤中多發(fā)揮抑癌基因功能，如miR-134通過靶向調(diào)控ITGB1抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］; miR-134能夠抑制子宮內(nèi)膜癌干細(xì)胞增殖和侵襲［6］。但miR-134與肺腺癌化療耐藥的關(guān)系尚不清楚。本研究中，我們將miR-134模擬物轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞后其對(duì)順鉑的半數(shù)抑制量顯著下降，而A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134抑制物后其對(duì)順鉑的半數(shù)抑制量顯著升高。表明miR-134能夠增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

我們?cè)鴪?bào)道過miR-134能夠通過靶基因FOXM1抑制非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［4］。FOXM1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，F(xiàn)OXM1在很多的人類腫瘤中(包括人肺癌、原發(fā)性胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等)表達(dá)量上調(diào)，目前已確認(rèn)FOXM1參與了多種致癌信號(hào)途徑的調(diào)控［10］。為研究FOXM1在miR-134調(diào)控順鉑耐藥中的作用，我們通過Western blot技術(shù)檢測(cè)FOXM1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示FOXM1 在A549/CDDP細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，miR-134能夠抑制FOXM1蛋白表達(dá)。應(yīng)用干擾RNA沉默F(xiàn)OXM1后，A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加。表明FOXM1參與了miR-134誘導(dǎo)的順鉑耐藥。

MRP1屬于ATP-binding cassette ( ABC)超家族跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已有研究顯示其在順鉑耐藥的肺腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，是導(dǎo)致肺癌化療耐藥的重要機(jī)制［11-13］。因此有必要檢測(cè)MRP1是否受miR-134調(diào)控。Western blot結(jié)果顯示，miR-134能夠抑制MRP1蛋白的表達(dá)。

綜上所述，miR-134在肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-134能夠提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其作用可能是通過調(diào)控FOXM1和MRP1基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

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miR-134 regulates cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cells

YU Wan-jun1，WANG Yi-ping2，LI Ji-peng2，WANG Hua-ying1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，2Department of Laboratory Medicine，Yinzhou People’s Hospital，Ningbo 315040，China.E-mail: yingmeire@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the roles of microRNA-134 ( miR-134) in the cisplatin resistance of lung adenocarcinoma cells.METHODS: miRNA microarray was applied to compare the miRNA expression profile between A549/ CDDP and A549 cells.Real-time PCR was used to confirm the expression of miR-134.miR-134 mimics and inhibitors were transfected into A549/CDDP and A549 cells，respectively.MTT assay was used to detect the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin.Western blot was applied to test whether miR-134 regulated forkhead box protein M1 ( FOXM1) and multidrug-associated protein 1 ( MRP1) expression.RESULTS: Based on the data of miRNA microarray，13 miRNAs were found to be differentially expressed in A549/CDDP cells compared with A549 cells，among which miR-134 was the most significantly down-regulated one.Compared with control group，A549/CDDP cells transfected with miR-134 mimics showed greatly enhanced sensitivity to cisplatin as indicated by IC(50)values ( P＜0. 01).In contrast，suppression of the miR-134 level in the A549 cells resulted in a decreased sensitivity to cisplatin ( P＜0. 01).FOXM1 siRNA down-regulated the protein levels of FOXM1.A549/CDDP cells transfected with si-FOXM1 showed enhanced sensitivity to cisplatin ( P＜0. 01).In addition，the result of Western blot showed that miR-134 repressed MRP1 protein expression.CONCLUSION: miR-134 effectively increases the sensitivity of lung adenocarcinoma cells to cisplatin，and this effect of miR-134 may be partly due to its regulation of FOXM1 and MRP1 expression.

［KEY WORDS］MicroRNA-134; Lung adenocarcinoma; Cisplatin resistance; Forkhead box protein M1; Multidrug-associated protein 1

通訊作者△Tel: 0574-87016828; E-mail: yingmeire@163.com

*［基金項(xiàng)目］浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.LY14H160002) ;浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目( No.2014KYB248)

［收稿日期］2015-01-26［修回日期］2015-03-26

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1214-05

［中圖分類號(hào)］R730. 23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.011