左卡尼汀抑制尿毒癥血清誘導的紅細胞衰亡

孫　云，柳　剛，李學剛，時一民，關廣聚△(山東大學第二醫(yī)院血液凈化科，濟南市委門診部，山東濟南50033)

左卡尼汀抑制尿毒癥血清誘導的紅細胞衰亡

孫云1，柳剛1，李學剛1，時一民2，關廣聚1△
(1山東大學第二醫(yī)院血液凈化科，2濟南市委門診部，山東濟南250033)

［摘要］目的:探討左卡尼汀對尿毒癥患者紅細胞的保護作用及機制。方法:將2%健康人紅細胞懸液在以下3組不同的體外培養(yǎng)液中孵育:對照組( C組)、尿毒癥血清組( U組)和尿毒癥血清+左卡尼汀組( L組)。分別在孵育24和48 h時，留取紅細胞，使用流式細胞術檢測紅細胞衰亡(用磷脂酰絲氨酸表達率代表紅細胞衰亡)和紅細胞活性氧簇( ROS)的含量，并采用酶聯免疫法檢測紅細胞谷胱甘肽( GSH)的含量。結果:紅細胞衰亡隨孵育時間延長而增加，U組較C組明顯增加，L組較U組明顯降低。U組的紅細胞ROS生成較C組明顯增加，而紅細胞GSH生成明顯減少。L組的紅細胞ROS生成較U組明顯減少，而GSH生成明顯增加。結論:尿毒癥血清誘導正常紅細胞加速衰亡，且衰亡率具有時間依賴性。而左卡尼汀可以抑制尿毒癥血清誘導的紅細胞衰亡，其機制可能與抗氧化有關。

［關鍵詞］尿毒癥血清;紅細胞衰亡;左卡尼汀;氧化應激

腎性貧血為慢性腎衰竭常見并發(fā)癥之一。導致腎性貧血主要原因為促紅細胞生成素( erythropoietin，EPO)分泌減少、鐵劑缺乏、紅細胞壽命縮短等，多數患者在補充EPO和鐵劑后能夠得到有效糾正。但是在臨床上仍有效果不佳者，稱為難治性貧血。研究發(fā)現左卡尼汀( L-carnitine，LC)對該類難治性貧血有一定療效［1-2］，其相關機制可能與LC改變了紅細胞膜的滲透脆性等［3-4］因素有關。LC是脂肪動員的輔因子，可以通過加強脂肪β氧化供能，還具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，臨床上常用于治療心力衰竭或繼發(fā)性肉堿缺乏癥，而維持性血液透析是繼發(fā)性肉堿缺乏癥的常見原因之一。本研究旨在通過體外實驗觀察LC對尿毒癥血清中紅細胞的保護作用并探討相關機制，以期為臨床防治腎性貧血提供新的思路和途徑。

材料和方法

1材料

左卡尼汀注射液、PBS液和2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯( DCFH-DA)均購自Sigma;谷胱甘肽( glutathione，GSH)檢測試劑盒(上海碧云天) ; Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基) ; 0.22 μm無菌濾器( Millipore) ;無菌12孔板( Greiner)。高速離心機(上海安亭) ;－80℃冰箱(青島海爾) ;無菌工作臺( ESCO Class II) ;二氧化碳培養(yǎng)箱( MCO-18AIC) ;流式細胞儀( BD) ;酶標儀(安圖2010)。

2血清制備

選取慢性腎功能衰竭維持性血液透析患者20例，其中男12例，女8例，平均年齡( 42.3±2.1)歲。該實驗通過本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。入選標準: ( 1)均已進行維持性血液透析1年以上; ( 2)血壓控制在150/90 mmHg以下; ( 3)近期無明顯感染、重度心力衰竭; ( 4)無糖尿病病史。所選病例中原發(fā)疾病為腎小球腎炎8例、原發(fā)性高血壓7例和藥物性腎損傷5例。透析前清晨空腹采靜脈血8 mL，標本用普通生化管裝盛，30 min內離心( 3 000 r/min)，收集上清置于2 mL的無菌EPPendorf管中。無菌條件下留取、分離，－20℃冷凍保存，10 d內備用，實驗時所有混合血清用0.22 μm的無菌濾膜過濾除菌后使用?；旌涎宓募◆? serum creatinine，SCr)值為( 1 373.34±23.56) μmol/L，尿素氮( blood urea nitrogen，BUN)值為( 78. 65±12.95) mmol/L。根據需要配制成為所需濃度的尿毒癥血清培養(yǎng)液。

3實驗方法

3.1外周血紅細胞的體外孵育清晨抽取健康志愿者空腹靜脈血10 mL，EDTA抗凝，用PBS調整細胞濃度為1×109/L(即2%的紅細胞懸液)。紅細胞置于12孔板，加入如下不同培養(yǎng)基后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

3.2實驗設計將新鮮配置的2%紅細胞懸液按照不同的體外培養(yǎng)基分成以下3組: ( 1)正常對照( control，C)組:培養(yǎng)基為PBS溶液; ( 2)尿毒癥血清( uremic serum，U)組:培養(yǎng)基為30%尿毒癥血清+ 70%PBS溶液; ( 3) LC( L)組:培養(yǎng)基為30%尿毒癥血清+70%PBS溶液+ LC(終濃度調節(jié)為200 μmol/ L)。設24 h和48 h 2個觀察點，定點收集孵育中的紅細胞，離心，洗滌，至少2次。并在1 h內測定相關數據。其中L組紅細胞提前加入相應濃度的LC孵育2 h后，PBS洗滌，再加入LC與其它2組同時開始孵育。每個觀察點設有3個平行對照孔，相同實驗重復3次，測得同一時點數據后，取平均值作為該時點最終值。

3.3檢測紅細胞衰亡率細胞凋亡早期的特征之一是細胞外膜表達磷脂酰絲氨酸( phosphatidylserine，PS)。Annexin V是一種分子量為35～36 kD 的Ca2 +依賴性磷脂結合蛋白，與PS具有高度親和力，故可通過細胞外膜暴露的PS與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。紅細胞沒有細胞核，故將紅細胞凋亡特稱為紅細胞衰亡( eryptosis)。當紅細胞早期衰亡時，同樣表達PS。故Annexin V測定的PS表達率可代表紅細胞衰亡。將收集到的紅細胞用PBS洗滌后，加入緩沖液、10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。流式細胞儀選擇激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，作為檢測紅細胞衰亡的指標。

3.4檢測紅細胞內活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)的含量加入以PBS稀釋熒光探針DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。37℃搖床孵育20min，使探針與細胞充分結合，DCFH-DA與ROS反應后生成帶有熒光特性的二氯熒光素。PBS洗滌細胞3次，徹底去除未進入細胞的DCFH-DA。PBS將紅細胞重懸后，流式細胞儀選擇激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm檢測熒光強度。

3.5檢測紅細胞GSH利用ELISA原理，按試劑盒說明，使用酶標儀檢測紅細胞GSH的含量。

4統計學處理

所有數據均用SPSS 12. 0處理，所有計數資料均用均數±標準誤( mean±SEM)表示，多個組間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法( LSD法)。兩指標間相關性采用Pearson法。以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1健康人紅細胞在不同培養(yǎng)基中的衰亡率

隨著體外孵育時間延長，紅細胞衰亡增加。加入尿毒癥血清后，紅細胞衰亡較C組明顯增加。而同時加入左卡尼汀后，紅細胞衰亡較U組明顯降低，見圖1、表1。

Figure 1.The result of eryptosis detected by flow cytometry.圖1　流式細胞術檢測紅細胞細胞衰亡率

2健康人紅細胞在不同培養(yǎng)基中的ROS和GSH

隨著體外孵育時間延長，紅細胞ROS生成增加，GSH生成減少。當加入尿毒癥血清后，二者變化更為明顯，即U組紅細胞ROS生成較C組明顯增加，同時紅細胞GSH生成明顯減少。當加入左卡尼汀后，L組紅細胞ROS生成較U組明顯減少，紅細胞GSH生成明顯增加，見圖2、表1。

3氧化應激與紅細胞衰亡的相關性分析

以ROS和GSH為氧化應激指標，進一步分析其與紅細胞衰亡的相關性，結果顯示紅細胞衰亡與ROS呈正相關，GSH與ROS呈負相關，見表2。

討論

腎性貧血的普遍存在直接影響慢性腎功衰竭患者的生存質量，降低了維持性腎臟替代治療患者生存率，故有效治療腎性貧血具有重要的臨床意義。本研究使用尿毒癥血清和LC刺激健康紅細胞，通過觀察紅細胞衰亡的變化發(fā)現LC的保護作用，并同時觀察了紅細胞氧化應激的相關指標的變化。

本實驗通過加入尿毒癥血清而模擬尿毒癥內環(huán)境，結果顯示，健康紅細胞體外孵育時，隨孵育時間延長衰亡發(fā)生增加。加入尿毒癥血清后，在相同觀察時點紅細胞衰亡增加，這與Bonomini等［5］研究結果一致，提示血液透析患者的內環(huán)境可以誘導紅細胞過度衰亡。尿毒癥患者的紅細胞壽命縮短(由正常的120 d縮短至90 d左右)，這是腎性貧血的重要原因之一，其中過多的紅細胞衰亡是導致紅細胞壽命縮短的直接原因。已有多項證據指出糖尿病、膿毒血癥、地中海貧血、慢性腎功衰竭等多種疾病的各種不同內環(huán)境條件均能導致紅細胞衰亡［6］。紅細胞衰亡具有多重生理作用，直接促進貧血的發(fā)生，或者PS表達造成細胞之間黏附，激活凝血過程。Bonomini等［5］的研究還證實紅細胞的衰亡是可逆的，他將尿毒癥血清中的紅細胞又重新移至健康人血清中，紅細胞衰亡減少。這提示我們通過抑制或者逆轉紅細胞衰亡有可能成為治療貧血的有效方法。本實驗也證實了LC對尿毒癥血清中的紅細胞發(fā)揮了抗凋亡的作用，減少了紅細胞的凋亡。

Figure 2.ROS production in the erythrocytes detected by flow cytometry，and the blue area represents the level of ROS.圖2　流式細胞術檢測紅細胞ROS

表1　體外紅細胞孵育的不同時點PS、ROS和GSH水平Table 1.The results of eryptosis，ROS and GSH at different times ( Mean±SEM.n =6 )

表2　在不同觀察時點各指標間相關性分析Table 2.The correlation analysis of different index at different time points

氧化應激與多種細胞的凋亡具有密不可分的關系［7］，而抗氧化藥物可通過減輕氧化應激而發(fā)揮抗凋亡作用［8］。本研究中，在紅細胞衰亡增加的同時，紅細胞的ROS增加和GSH減少，且在不同的觀察時點紅細胞衰亡率與ROS呈正相關，與GSH呈負相關。這提示紅細胞衰亡與氧化應激之間存在一定的聯系，氧化產物促進衰亡，而抗氧化產物抑制衰亡。那么我們推測尿毒癥血清可能通過增強氧化應激而誘導紅細胞衰亡。尿毒癥內環(huán)境的氧化應激產物對紅細胞產生不良影響。維持性血液透析患者反復的接觸透析材料和透析液，貧血治療過程中大量補充鐵劑等都導致大量活性氧產生［9］。Usberti等［10］證實過度氧化應激增加紅細胞衰亡，是引起尿毒癥貧血的原因之一。這就提示抗氧化藥物或許有利于治療腎性貧血。LC具有抗氧化的藥理作用。LC可以延長維持性血液透析患者紅細胞的壽命，Arduini等［11］在臨床研究中證實對維持血液透析患者靜脈補充LC24周后，紅細胞壽命相對明顯延長了8.5 d。我們用LC對含有尿毒癥血清的培養(yǎng)液中紅細胞進行了干預，同步觀察氧化應激產物指標ROS和抗氧化應激指標GSH變化。我們發(fā)現加入LC后紅細胞衰亡明顯減少，并且也伴隨著ROS明顯減少和GSH明顯增加，且各指標相互間存在著顯著的相關性。說明LC通過減輕氧化應激抑制紅細胞衰亡。這也提示LC對于尿毒癥血清中的紅細胞來說，是一種有效的氧自由基清除劑，它通過減輕氧化應激保護了紅細胞。

綜上所述，本研究體外模擬尿毒癥內環(huán)境，并加入LC進行干預，觀察了紅細胞衰亡率和ROS、GSH的變化，提示LC可能通過減輕氧化應激而抑制尿毒癥血清誘導的紅細胞衰亡，發(fā)揮治療腎性貧血的作用。

［參考文獻］

［1］Wanic-Kossowska M，Kazmierski M，Pawliczak E，et al.Combined therapy with L-carnitine and erythropoietin of anemia in chronic kidney failure patients undergoing hemodialysis［J］.Pol Arch Med Wewn，2007，117( 1-2) : 14-19.

［2］Kadiroglu AK，Yilmaz ME，Sit D，et al.The evaluation of postdialysis L-carnitine administration and its effect on weekly requiring doses of rHuEPO in hemodialysis patients［J］.Ren Fail，2005，27( 4) : 367-372.

［3］Nikolaos S，George A，Telemachos T，et al.Effect of L-carnitine supplementation on red blood cells deformability in hemodialysis patients［J］.Ren Fail，2000，22( 1) : 73-80.

［4］Matsumura M，Hatakeyama S，Koni I，et al.Correlation between serum carnitine levels and erythrocyte osmotic fragility in hemodialysis patients［J］.Nephron，1996，72 ( 4) : 574-578.

［5］Bonomini M，Sirolli V，Settefrati N，et al.Increased erythrocyte phosphatidylserine exposure in chronic renal failure［J］.J Am Soc Nephrol，1999，10( 9) : 1982-1990.

［6］Lang F，Lang E，Fller M.Physiology and pathophysiology of eryptosis［J］.Transfus Med Hemother，2012，39( 5) : 308-314.

［7］曹軍軍，楊茂偉，郭保磊，等.枸櫞酸鐵胺通過提高ROS水平激活MAPK通路并誘導成骨細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2013，29( 3) : 476-480.

［8］戴紅良，賈桂枝，劉堃，等.左卡尼汀通過抑制鈣/鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ信號通路抑制過氧化氫誘導的大鼠心肌細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2013，29 ( 7) : 1250-1254.

［9］Nagababu E，Gulyani S，Earley CJ，et al.Iron-deficiency anemia enhances red blood cell oxidative stress［J］.Free Radic Res，2008，42( 9) : 824-829.

［10］Usberti M，Gerardi G，Bufano G，et al.Effects of erythropoietin and vitamin E-modified membrane on plasma oxidative stress markers and anemia of hemodialyzed patients ［J］.Am J Kidney Dis，2002，40( 3) : 590-599.

［11］Arduini A，Bonomin M，Elaine J，et al.Effect of L-carnitine administration on erythrocyte survival in haemodialysis patients［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21 ( 9) : 2671-2672.

L-carnitine inhibits eryptosis induced by uremic serum

SUN Yun1，LIU Gang1，LI Xue-gang1，SHI Yi-min2，GUAN Guang-ju1
(1Department of Hemodialysis，The Second Hospital of Shandong University，2The Outpatient Department of Jinan Municipal Committee，Jinan 250033，China.E-mail: guangj@ sdu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate whether L-carnitine ( LC) inhibits the eryptosis effect of uremic serum on erythrocytes.METHODS: Erythrocyte suspension ( 2%) was cultured and divided into 3 groups in vitro: control group ( C group)，uremic serum group ( U group，30% uremic serum)，and uremic serum + LC group ( L group，30% uremic serum +200 μmol/L LC).Erythrocytes were collected at 24 h and 48 h.Eryptosis ( phosphatidylserine expression represents eryptosis) was estimated by flow cytometry with Annexin V staining.The content of reactive oxygen species ( ROS) was also detected.Glutathione ( GSH) was measured by ELISA.RESULTS: Eryptosis in C group was increased as the incubating time extended.Eryptosis in U group was higher than that in C group，while that in L group was lower than that in U group.Meanwhile，ROS content was higher and GSH was lower in U group than those in C group.ROS content was lower and GSH was higher in L group than those in C group.CONCLUSION: LC inhibits uremic serum-induced eryptosis by decreasing ROS and increasing GSH，thus attenuating oxidative stress.

［KEY WORDS］Uremic serum; Eryptosis; L-carnitine; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0531-85875449; E－mail: guangj@ sdu.edu.cn

［收稿日期］2014-12-08［修回日期］2015-05-15

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1324-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.031