細胞轉染技術在本科實驗教學中的應用

王宏剛, 白艷玲, 朱玉山, 張金紅, 劉 方

(南開大學 生物實驗教學中心, 天津 300071)

細胞轉染技術在本科實驗教學中的應用

王宏剛, 白艷玲, 朱玉山, 張金紅, 劉 方

(南開大學 生物實驗教學中心, 天津 300071)

結合本科生實驗教學的特點,將細胞轉染技術改造成適合本科生實驗教學的內容。將含有線粒體信號肽和DsRed基因序列的載體MitoDsred轉入HeLa細胞,在熒光顯微鏡下檢測到發(fā)出紅色熒光的DsRed定位于線粒體基質中。該實驗可以單獨開設,也可以與其他實驗技術組合成基礎性或綜合性實驗開設。通過該實驗可以幫助學生掌握細胞轉染及蛋白亞細胞定位的相關知識,提高學生的動手能力和綜合素質。

細胞轉染； 教學改革； 實驗教學

細胞轉染是一種在體外利用媒介將外源的分子(如DNA,RNA)導入真核細胞的實驗技術。目前,細胞轉染技術已經廣泛應用于真核細胞基因功能研究及表達調控等多個研究領域,成為細胞生物學、遺傳學、基礎醫(yī)學等多個學科科研中所必須的實驗技能[1-2]。近幾年來,如何通過實驗教學來培養(yǎng)學生的基本實驗技能和科研能力已經成為實驗教學改革的方向[3-4]。為了能夠讓生命科學類專業(yè)本科生熟練掌握這項實驗技術,設計了“真核細胞遺傳轉化及細胞器定位實驗”。在該實驗中,通過PEI介導法將帶有線粒體信號肽和DsRed基因序列的載體MitoDsRed[5]轉入Hela細胞中,表達得到線粒體信號肽和DsRED的融合蛋白。在線粒體信號肽的引導下,DsRED定位于線粒體,并在熒光顯微鏡下檢測到紅色熒光。

1 實驗材料與主要試劑

(1) 實驗材料：質粒MitoDsRed、人宮頸癌Hela細胞系。

(2) 主要試劑： DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PEI溶液、甲醛溶液、DAPI

2 實驗方法

(1) 細胞復蘇:在實驗前一周,復蘇Hela細胞,并培養(yǎng)至最佳狀態(tài)。

(2) 細胞爬片:轉染前一天,用眼科鑷夾取經洗液處理過的蓋玻片在酒精燈火焰處做無菌處理,放到培養(yǎng)皿中，接種細胞數(shù)到5×105個/mL,培養(yǎng)過夜。

(3) 轉染:取90μL DMEM培養(yǎng)基,加入2 μg 質粒MitoDsRed,混合后再加入預先配置好的8 μL PEI溶液,混勻,室溫放置10 min,加入細胞培養(yǎng)皿中。

(4) 細胞固定:24 h以后,移除培養(yǎng)基，加入新鮮配制的甲醛固定液(37 ℃預熱的培養(yǎng)基與甲醛溶液的體積比為9∶1),37 ℃固定30 min,棄掉固定液,PBS清洗3次,加入0.02%Triton-100 室溫處理5 min,PBS清洗3次。

(5) 制片:取潔凈的載玻片一張,滴加3μL封片劑(含有DAPI),用眼科鑷夾取長有細胞的蓋玻片,用吸水紙洗掉殘留的液體后,反扣于載玻片上的封片劑處,用濾紙輕輕吸去多余的封片劑,最后用指甲油在蓋玻片周圍涂抹封片。

(6) 觀察:將裝片置于熒光顯微鏡觀察下觀察。

3 實驗結果與討論

3.1 DsRed在線粒體上的定位

載體MitoDsRed轉入Hela細胞中,表達得到線粒體信號肽和DsRED的融合蛋白。在線粒體信號肽的引導下,DsRED定位于線粒體,在熒光顯微鏡下,經紫外光激發(fā),可觀察到經DAPI染色細胞核發(fā)出藍色熒光的細胞核,經綠光激發(fā),可觀察到定位于線粒體上的DsRED發(fā)出紅色熒光，如圖1所示。

圖1 經細胞轉染后定位于Hela細胞線粒體上的DsRed(100×)

3.2 實驗注意事項

(1) 選擇細胞種類時盡量選擇生長較快、貼壁較好的細胞株系。生長較快的細胞易于培養(yǎng),可節(jié)省實驗準備時間。貼壁較牢的細胞在蓋玻片上生長時,鋪展較平,細胞層較薄,以方便實驗結果觀察。

(2) 轉染方法的選擇。細胞轉染的方法很多,常用的有脂質體介導法[6]、陽離子聚合物介導法[7]、基因槍注射[8]、電轉導法[9]、病毒介導法[10]等。這些方法均有各自的特點,在實驗教學中,應該根據(jù)實際情況選擇操作簡單、耗時少、成功率較高的實驗方法。

(3) 報告基因的選擇。報告基因是選擇轉染是否成功的重要方法。常用的報告基因也很多,氯霉素乙酰轉移酶基因、β-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因、熒光蛋白基因等[11]。其中,熒光蛋白在轉入細胞后可被激發(fā)出熒光,使用熒光顯微鏡就可以直接觀察。熒光蛋白的這種特性使其成為在實驗教學中應用最多的報告基因。在對熒光蛋白的種類進行選擇時需考慮熒光的強度和熒光淬滅的速度等因素。

4 實驗課程設計與教學安排

通過該實驗,學生能夠直觀地了解細胞中線粒體的分布,加深對理論課中線粒體結構及功能相關知識點的理解；掌握細胞轉染的實驗原理及操作流程；熟悉熒光顯微鏡的成像原理及使用方法。在教學中,可根據(jù)實際課時、實驗室硬件條件等具體情況，可分別作為基礎性實驗、開放性實驗或探究性實驗開設。

4.1 基礎性實驗課

基礎性實驗課最基本的特點就是課時固定,一般情況下,每次課為4～5個課時。在教學實施過程時,需要由任課教師提供受體細胞、質粒等實驗材料和完整的實驗流程,由學生在實驗前一天進行細胞轉染的操作(1課時),轉染24 h后進行固定、制片和觀察(4課時)?？紤]到基礎實驗課上課人數(shù)較多且熒光顯微鏡數(shù)量有限,在組織教學時,可將每次課的學生分為2組或3組,分別采用不同的轉染時間,即可以錯開使用熒光顯微鏡的時間,而且可以讓學生比較不同轉染時間對實驗結果的影響。

此外,將該實驗作為“質粒的提取”實驗的后續(xù)實驗內容,可組成一個9課時的綜合實驗。利用一次課完成質粒提取(4課時),再安排一次課由學生使用自己提取的質粒進行細胞轉染和檢測(5課時),加強課程實驗項目的綜合性,提高學生的學習興趣。

4.2 開放性實驗課

開放性實驗課一般針對較高年級的學生開設,學生在經過基礎性實驗課的學習,掌握基本的實驗技能的基礎上,由任課教師設計實驗框架。學生根據(jù)自己的情況,自由安排實驗時間,在規(guī)定的時間內完成實驗。在本實驗的設計中,可由學生先完成細胞培養(yǎng)、質粒提取等工作,然后進行細胞轉染及檢測等實驗內容,根據(jù)實際情況,可安排18～24個課時完成。

4.3 探究性實驗課

探究性實驗一般作為本科生畢業(yè)論文的先導性實驗,要求學生通過查閱資料后,在教師的指導下,設計實驗方案,對某一問題進行研究,并給出一定的實驗結果。作為探究性實驗,可指導學生設計實驗對影響細胞轉染效果的因素進行探究,例如:通過對轉染效率、細胞存活率等參數(shù)的考察來探究不同細胞轉染方法的特點,或提供一個陌生的細胞系,由學生通過實驗探究一套合適的轉染方法。共需32～48個學時。

5 結束語

將科研實驗室常用的實驗技術改造成適合本科生實驗教學中使用的實驗內容一直是高等教育教學改革的研究熱點。為本科生開設多層次細胞轉染實驗不但可以讓本科生掌握細胞轉染技術的原理和操作要點,還可以提高學生的動手能力和科研素養(yǎng),為本科生將來的進一步發(fā)展奠定良好的基礎[12]。

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[1] 斯佩特克DL,戈德曼RD, 萊因萬德LA.細胞實驗指南[M].黃培堂，譯.北京:科學出版社,2001.

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[3] 印莉萍,祁曉廷,劉祥林，等.堅持科研成果向實驗教學轉化，提高探究型實驗教學的效率[J].實驗技術與管理,2005,22(9):4-6.

[4] 柳潤輝,陳海生,李慧梁，等.科研項目轉化為探究性實驗的教學實踐[J].藥學教育,2013,29,(6):37-39.

[5]ZhuY,LiM,WangX,etal.Caspasecleavageofcytochromec1disruptsmitochondrialfunctionandenhancescytochromecrelease[J].CellRes,2012,22:127-141.

[6] 楊云廷,付崇羅.陽離子脂質體Lipofectamine2000對PC12細胞轉染效率的研究[J].生物技術通報,2011(5):231-235.

[7] 尉繼征,林磊,熊偉，等.新型陽離子基因傳遞載體PEI-PBLG的細胞轉染研究[J].生物工程學報,2007,23(2):229-234.

[8] 張彥桃.植物葉綠體轉化的基因槍法研究進展[J].生物學教學,2010,35(1):6-9.

[9] 宋永利,陸昕,邱爽，等.巨噬細胞RAW264.7的培養(yǎng)及電轉染條件的優(yōu)化[J].西北農業(yè)學報,2010,19(9) :21-24.

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[11] 楊宇,李江江,王項，等.報告基因及其應用研究進展[J].生命科學研究,2011,15(3):277-282.

[12] 張金龍,柴海莉.創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式的探索與實踐[J].實驗技術與管理,2014,31(6):27-29,32.

Application of cell transfection technology in experimental teaching for undergraduates

Wang Honggang, Bai Yanling, Zhu Yushan, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological Experimental Teaching Center, Nankai University, Tianjin 300071， China)

The cell transfection technique is commonly employed in the cell biology study.Undergraduate students majoring in Life Science should systematically master this technique.According to the characteristics of undergraduates’ experimental teaching, to apply it in the experimental teaching for the undergraduates is adapted. Firstly,the vector containing a fusion gene of mitochondrial signal peptide andDsRedwas transferred into HeLa.Then,DsRedwas detected in mitochondrial matrix by fluorescence microscope.This experiment can be offered singly or unitarily with other experimental techniques as a basic or integrated experiment course.This can help students master the knowledge of cell transfection and protein subcellular localization ,and improve their operating ability and integrated quality.

cell transfection; teaching reform; experimental teaching

2015- 01- 28 修改日期：2015- 03- 10

國家基礎學科人才培養(yǎng)基金項目“南開大學生物學人才培養(yǎng)基地”(J1103503); 國家基礎學科人才培養(yǎng)基金“條件建設項目”(J1310003)；南開大學2014年本科一般教學改革項目“將現(xiàn)代實驗技術引入本科實驗教學，構建‘公能’特色實驗教學內容體系”；南開大學示范精品課程項目“遺傳學實驗”

王宏剛(1982—)，男，山西繁峙，碩士，實驗師，從事細胞生物學實驗和遺傳學實驗教學

E-mail：whg820604@nankai.edu.cn

朱玉山(1971—)，男，內蒙古赤峰，博士，副教授，研究方向為細胞自噬與細胞凋亡調控,從事遺傳學實驗教學.

E-mail：zhuys@nankai.edu.cn

G642.0；Q813

B

1002-4956(2015)8- 0068- 02