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    中藥多糖質(zhì)量控制研究進展

    2015-05-05 07:29:08肖作奇
    中國醫(yī)藥導報 2015年4期
    關鍵詞:單糖分子量多糖

    肖作奇

    [摘要] 本文就近年來常見中藥多糖質(zhì)量控制方法,在總糖含量測定方法、分子量大小和分布測定方法、單糖組成和摩爾比測定方法、雜質(zhì)檢測方法等方面進行綜述,希望能夠為中藥多糖的研究和開發(fā)提供一定的參考。

    [關鍵詞] 多糖;質(zhì)量控制;總糖含量;分子量;單糖

    [中圖分類號] R284 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2015)02(a)-0159-06

    多糖由10個或10個以上單糖通過縮合而形成的鏈狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在自然界中,植物、動物、微生物和海洋生物中都有多糖的存在。近年來,已發(fā)現(xiàn)不少多糖類物質(zhì)具有很好的生物活性,如抗腫瘤、免疫促進活性、抗病毒、降血糖、抗凝血等[1]。多糖的多樣化生物活性使多糖類藥物的開發(fā)與研究成為了當前新藥研究的熱點。

    多糖質(zhì)量控制的問題是多糖類新藥研發(fā)中的瓶頸問題[2]。多糖是一類分子量相對較大的物質(zhì),其結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)類似,也可分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu),而多糖的生物與其初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)都有密切的關系。多糖的一級結(jié)構(gòu)就包含分子量大小及分布、單糖組成及摩爾比、糖苷鍵鏈接方式、重復結(jié)構(gòu)單元和分支度等多方面的問題。這些問題使多糖的定性和定量檢測成為一個很大的難題。現(xiàn)就多糖質(zhì)量控制的問題,在總糖含量測定方法、分子量大小和分布測定方法、單糖組成和摩爾比測定方法、雜質(zhì)檢測方法等方面進行綜述。

    1 多糖中總糖含量測定方法

    多糖的總糖含量決定了其純度,是多糖藥物質(zhì)量控制最基本的問題。多糖總糖含量測定一般利用單糖的縮合反應進行顯色后用比色法測定;也有直接采用高效液相色譜法(HPLC)測定多糖含量[3],但由于缺少標準對照和有效檢測手段等因素,該方法并未得到廣泛認同。

    1.1 苯酚/硫酸法

    多糖在濃硫酸作用下,迅速水解脫水生成糠醛或糠醛類似物,然后與苯酚縮合生成1種紅色化合物,在一定范圍內(nèi)生成物顏色深淺和多糖中總糖含量成線性關系,由此來測定多糖中總糖含量。該法所采用試劑的價格便宜,蛋白質(zhì)等物質(zhì)不干擾測定,靈敏度高,故被廣泛采用[4-7]。該法需要注意的問題有:己糖在顯示后最大吸收波長一般在490 nm處,戊糖和糖醛酸顯示后最大吸收波長一般在480 nm處;苯酚在空氣中易氧化生成醌類物質(zhì),導致吸收波長發(fā)生偏離或吸收值不穩(wěn)定,所以苯酚在使用前一般宜進行重蒸餾,且需要現(xiàn)配現(xiàn)用;不同多糖在使用該法時,苯酚、硫酸用量、反應溫度和時間等都需要進行優(yōu)化。

    1.2 蒽酮/硫酸法

    多糖在濃硫酸作用下,迅速生成糠醛或糠醛類似物,然后與蒽酮縮合生成一種藍綠色化合物,在一定范圍內(nèi)生成物顏色深淺和多糖中總糖含量成線性關系,由此來測定多糖中總糖含量。該法和苯酚/硫酸法的不同是一些蛋白質(zhì)類物質(zhì)會干擾總糖含量的測定,所以在測定前一般需要通過前處理去掉樣品中的蛋白質(zhì)。該法需要注意的事項有:糖與蒽酮形成的有色物質(zhì)最大吸收波長一般在625 nm處;蒽酮-硫酸溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。該法操作步驟較苯酚/硫酸法更為簡單方便[8-10]。

    1.3 3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法

    多糖水解后生產(chǎn)的還原糖與DNS在中性或堿性條件下生成生成3-氨基-5-硝基水楊酸,顯棕紅色,在一定范圍內(nèi),反應產(chǎn)物的顏色深淺和還原糖的量成線性關系,由此可用于測定多糖樣品中還原糖的含量。該法可測定多糖樣品中游離還原糖的含量;同時也可將多糖水解后,測定多糖中總糖的含量。3-氨基-5-硝基水楊酸一般在540 nm處有最大吸收[11-12]。該法不需要用到強酸,反應相對較為溫和。

    1.4 地衣酚/鹽酸法

    多糖在鹽酸作用下水解脫水生成糠醛和糠醛衍生物,然后和地衣酚結(jié)合生成有色化合物,最大吸收波長一般在660 nm處,其顏色深淺和多糖的量成線性關系,由此可用于多糖樣品中總糖含量的測定[13]。這種方法一般用于戊聚糖含量的測定。相對前面3種方法,這種方法使用較少。

    1.5 滴定法

    有斐林滴定法和間接碘量法等[14-15]。斐林滴定法的原理是將質(zhì)量濃度為0.1 g/mL氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.05 g/mL硫酸銅溶液等量混合,硫酸銅和氫氧化鈉反應,生成氫氧化銅沉淀,再與酒石酸鉀鈉發(fā)生反應,生成酒石酸鉀鈉銅絡合物。加熱條件下,用多糖樣品液滴定,多糖液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應,生成氧化亞銅沉淀,氧化亞銅再與試劑中的亞鐵氰化鉀反應生成可溶性的化合物,用次甲基蘭作指示劑,達到反應終點時,稍過量的還原糖將次甲基蘭還原,反應液由藍色變?yōu)闊o色,即為滴定終點,然后根據(jù)多糖液消耗量可計算出多糖液中還原糖的量。該法注意事項有:要求滴定在沸騰狀態(tài)下進行,操作繁瑣。間接碘量法是一種容量分析法,以氧化還原反應為基礎,與苯酚/硫酸法和蒽酮/硫酸法相比,操作過程繁瑣;而且在滴定的過程當中,要控制好速度,太快或太慢都將影響實驗結(jié)果;搖動過于劇烈都會使碘少量揮發(fā),使測定產(chǎn)生誤差。由于滴定法的諸多弊端,現(xiàn)在一般很少用于糖含量測定。

    2 多糖分子量大小和分布測定方法

    多糖的分子量大小表示方法有重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和黏均分子量(Mη)等。重均分子量用不同大小的分子的分子重量統(tǒng)計平均得到的數(shù)值,測定方法有光散射法、超速離心沉降速度法和凝膠滲透色譜法(GPC)等。數(shù)均分子量就是依據(jù)總體分子的個數(shù)求出分子量來的,測定方法有氣相滲透法、端基分析法、冰點降低法、GPC和膜滲透壓法等。采用黏度法測得的分子量稱為黏均分子量。多糖藥物的分子量一般在一個固定的范圍,所以對多糖分子量的檢測與其質(zhì)量穩(wěn)定性有密切關系。

    2.1 凝膠滲透色譜法

    GPC是根據(jù)不同分子量大小的多糖在凝膠層析柱上的洗脫體積成一定關系的特點來進行分子量大小和分布的測定。需要不同分子量大小的葡聚糖作為標準物質(zhì),繪制標準曲線[16-17]。一般而言,分子量越大,洗脫體積越小,分子量越小,洗脫體積越大。現(xiàn)在常用的樣品凝膠有Sephadex G系列葡聚糖、Sepharose瓊脂糖、Sephacryl丙烯葡聚糖、Bio-Gel聚丙烯酰胺凝膠等。Idris等[18]采用GPC法成功的測定了阿拉伯樹膠的分子量大小和分布范圍。

    2.2 高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)

    HPGPC是GPC和HPLC結(jié)合的產(chǎn)物,色譜柱有凝膠填料組成。多糖在凝膠色譜柱上洗脫時間(tR)和分子量大小成一定的關系,可先用已知分子量大小的葡聚糖作對照,得到一系列tR,繪制標準曲線,通過多糖樣品的tR和標準曲線求得未知多糖樣品的分子量大小[19-20]。和GPC相比,HPGPC分析時間更短,操作更加方便,重復性更好,結(jié)果可信度更高,但對儀器設備要求更高。由于糖類物質(zhì)缺少發(fā)色團,HPGPC常用檢測器有示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器,兩種檢測器都是通用型檢測器,但靈敏度相對紫外、熒光等檢測器較差。HPGPC常用的商品化色譜柱有TOSOH TSK-Gel系列、Shodex色譜柱等。Yang等[21]采用HPGPC法測得龍眼肉中1種中性多糖LPS-N的分子量為13.8 kD,兩種酸性多糖(LPS-A1和LPS-A2)分子量分別為1382 kD和571 kD。Sun等[22]用HPGPC法測得紫球藻中多糖分子量大小分別有2918.7、256.2、60.66、6.55 kD。Wang等[23]得到的一種綠茶中性多糖分子量通過HPGPC分析為21 247 D??梢哉f,HPGPC已經(jīng)成為多糖分子量大小和分布范圍測定的首選方法。

    2.3 黏度法

    黏性液體在流動過程中所受阻力的大小用黏度系數(shù)來表示(η)。多糖溶液的特性黏度(η)與聚合物相對分子量之間的關系,可以通過Mark-Houwink經(jīng)驗方程來計算[24]。黏度法測定多糖的分子質(zhì)量適用的分子量范圍為1×104~1×107。該法所需儀器設備簡單,操作容易,但結(jié)果準確度不高。

    2.4 端基法

    該法的基本原理是先測定單位重量多糖樣品中可測端基(如還原端基)之數(shù),然后再計算多糖的分子量[25]。

    其他多糖分子量測定方法還有滲透壓法、蒸汽壓法、光散射法、超濾法、冰點降低法等。

    3 多糖中單糖組成和含量測定方法

    天然藥物中的多糖一般不是由一種單糖構(gòu)成的,如寧夏枸杞多糖就是有木糖和葡萄糖組成,且還含有少量的鼠李糖、甘露糖和半乳糖[26];綠茶多糖含有阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多種單糖[27]。每一種多糖物質(zhì)都有其特征的單糖組成和單糖的摩爾比,可見對單糖組成和摩爾比的測定不僅僅在其結(jié)構(gòu)鑒定方面有重要意義,而且也可由于多糖藥物的質(zhì)量控制研究。多糖一般是由一系列分子量大小的物質(zhì)組成的復合物,現(xiàn)在還無法對其每一個分子量的糖進行定性定量分析。多糖的單糖組成種類和其摩爾比是相對固定的,由此對多糖單糖種類的鑒定和單糖摩爾比的分析做出相應規(guī)定,就能在一定程度上對多糖質(zhì)量進行有效控制。

    多糖在進行單糖組成分析前一般要經(jīng)過水解過程。多糖水解方法一般有酸水解法、酶解法和物理降解法,最常用的是酸水解法。酸水解常用到的酸有鹽酸、硫酸、三氟乙酸、乙酸、磷酸等[28-30]。酶解多糖反應較為溫和,無副產(chǎn)物或副產(chǎn)物少,但成本相對較高[31]。物理降解常見的有超聲波降解法等[32]。

    3.1 氣相色譜法(GC)

    GC法是最常見的用于單糖組成分析的一種方法。糖類物質(zhì)本身沒有很好的揮發(fā)性,不能直接進行氣相分析,所以必須經(jīng)過衍生化后才能使用GC進行定性定量分析。用于GC的單糖衍生方法已有許多報道。常用到的衍生化試劑有甲醚、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、三甲基硅醚、三甲基硅烷基肟、三甲基硅烷基烷基肟、糖醇乙酸酯等化合物[33]。Feng等[34]從夏枯草中得到一種多糖P32,用硫酸將其水解后,采用乙?;磻獙⑵溲苌?,GC分析結(jié)果表明P32多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,其摩爾比值是3.46∶49.32∶58.91∶0.43∶2.64∶3.11。Qin等[35]從泥鰍中得到一種動物多糖,命名為MAP,采用甲酸和硫酸混合將其酸水解,然后用糖醇乙酸酯法將其衍生,通過GC分析得知MAP是半乳糖、巖藻糖和甘露糖組成,其摩爾比值為5∶4∶1。Boldizsar等[36]將一種擔子真菌多糖用2 mol/L的三氟乙酸水解后,采用三甲基硅烷法將其衍生化,GC分析結(jié)果表明這種真菌多糖含有阿拉伯糖醇(0.01%~10.2%)、阿拉伯糖(0.09%~1.3%)、核糖(0.2%~1.8%)、巖藻糖(0.3%~1.2%)、甘露糖(0.01%~5.3%)、山梨醇(0.01%~0.05%)、果糖(0.08%~0.8%)、半乳糖(0.9%~29%)、葡萄糖(10%~53%)、糖醛酸(0.14%~3.7%)、蔗糖(0.03%~2%)、海藻糖(0.2%~1%)、纖維二糖(0.01%~0.6%)、麥芽糖(0.2%~1.9%)等。GC法分析單糖的特點是可同時分析超過10種單糖,準確度高;所需樣品量小,能檢測到含量很低的單糖。同時,GC法也有很多缺點,如操作繁瑣,需要較長時間的衍生過程;必須經(jīng)過衍生,衍生容易產(chǎn)生副產(chǎn)物,經(jīng)常1種單糖出現(xiàn)2個或2個以上的異構(gòu)峰等。

    3.2 高效液相色譜法

    HPLC也是一種使用較為廣泛的單糖組成分析方法,可分為不需柱前衍生和需要柱前衍生兩類。不需要柱前衍生的方法一般選用氨基色譜柱(離子排阻色譜柱)等,同時需要配備有示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器或質(zhì)譜檢測器等通用型檢測器。柱前衍生的方法一般在先用具有紫外吸收的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)等試劑進行衍生,然后選用C18色譜柱,配備紫外檢測器進行分析。Karlsson等[37]采用TSKgel Amide-80色譜柱配備蒸發(fā)光散射檢測器,使用甲酸銨溶液作流動相,不經(jīng)過衍生,直接成功對巖藻糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰-D-葡糖胺、乙酰神經(jīng)氨酸和葡糖醛酸等多種單糖進行定性定量分析。Xu等[38]采用NH2色譜柱配備有示差折光檢測器,選用乙腈-水作為流動相,通過HPLC分析得知2種黃芪多糖APS-1是由阿拉伯糖和葡萄糖構(gòu)成;摩爾比是1∶3.45,ASP-2是由鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖構(gòu)成,摩爾比為1∶6.25∶17.86。Lv等[39]分析絞股藍多糖時,選用PMP柱前衍生法,采用C18反相色譜柱和紫外檢測器,分析結(jié)果表明絞股藍多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成,其摩爾含量別分為6.3、10.3、47.1、5.6、24.0、128.4、25.0、101.4、71.1 μmol/L。Yang等[40]采用Lv等[39]同樣的方法分析當歸多糖的單糖組成,結(jié)果表明不同當歸多糖組成但單糖種類和摩爾比例不盡相同,是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖中幾種構(gòu)成。HPLC法相對GC法來說,操作較為簡單,沒有異構(gòu)峰產(chǎn)生,分析速度快;但是HPLC法的靈敏度沒有GC法高。

    3.3 紙色譜法(PC)

    PC法是根據(jù)不同物質(zhì)在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的,其固定相是紙上吸附的水,屬于正相分配色譜。Glegg等[41]選用紙色譜成功將鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖分離,其選用的展開劑為乙醇-吡啶-水體系,顯色劑選用的是苯胺草酸溶液和二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮溶液。商澎等[42]使用新中華速濾紙,用正丁醇-乙酸乙酯-吡啶-乙酸(25∶10∶10∶13)作為展開體系,苯胺-鄰苯二甲酸正丁醇溶液作顯色劑,鑒別出當歸多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成。田光輝等[43]采用PC鑒定中藥糙蘇中多糖的單糖組成,選用正丁醇-吡啶-水(6∶4∶1)作展開體系,鄰苯二甲酸-苯胺作顯色劑,發(fā)現(xiàn)糙蘇多糖中的單糖主要有葡萄糖,還含有少量的果糖和半乳糖。PC需要儀器設備非常簡單,操作也簡單易行,但是其靈敏度較差,如商澎等[42]在當歸多糖中發(fā)現(xiàn)的單糖種類就沒有Yang等[40]發(fā)現(xiàn)得多,而且不能進行定量分析,無法得知單糖的摩爾比值。這些因素使PC的使用越來越少。

    3.4 薄層色譜法(TLC)

    TLC分為不同的TLC和高效薄層色譜法(HPTLC),常用與多糖的初步分析[44]。Di等[45]采用高效薄層板,選用丙醇-水作展開體系,4-氨基苯甲酸-冰醋酸-磷酸水溶液作顯色劑,成功將半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖9種單糖分離,并建立靈芝多糖的指紋圖譜,用于不同品種靈芝的鑒別和鑒定。陶俊等[46]利用TLC測定油茶籽中多糖的單糖組成,選用的展開劑是乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(12∶3∶3∶2),選用的顯色劑為苯胺丙酮溶液,結(jié)果表明油菜籽多糖是由半乳糖、木糖、果糖、半乳糖等組成。江海霞等[47]采用TLC測定不同品種的小通草中多糖的單糖組成,用氯仿-冰醋酸-水(6∶7∶1)作展開劑,用苯胺-二苯胺-磷酸溶液作顯色劑,結(jié)果顯示,喜馬山旌節(jié)花多糖和中國旌節(jié)花多糖是由鼠李糖、果糖、半乳糖組成,青莢葉多糖由半乳糖聚合而成。和PC一樣,TLC所需儀器設備簡單、操作簡單,但其靈敏度較差。

    3.5 高效毛細管電泳法(HPCE)

    HPCE技術的出現(xiàn)晚于GC和HPLC技術,屬于較為前沿的一種分析技術。由于HPCE一般也是配備紫外檢測器,所以在進樣分析前一般需要進行衍生,PMP也是最為常用的一種衍生試劑。Yang等[48]采用HPCE技術分析南瓜多糖中單糖的組成,現(xiàn)將多糖樣品用2.0 mol/L三氟乙酸水解,然后用PMP衍生化,HPCE結(jié)構(gòu)表明南瓜多糖含葡萄糖(21.7%)、葡萄糖醛酸(18.9%)、半乳糖(11.5%)、阿拉伯糖(9.8%)、木糖(4.4%)和鼠李糖(2.8%)。Chen等[49]用HPCE技術分析一種刺五加多糖的單糖組成,同樣采用酸水解和PMP衍生的前處理方法,得到的結(jié)果表明,該種刺五加多糖含有鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,其摩爾比值是7.45∶18.63∶25.15∶0.93∶8.35∶2.79∶5.69。HPCE法對儀器設備要求較高,操作相對復雜,但其靈敏度高,是一種檢測多糖中單糖組成和摩爾比很好的技術手段。

    4多糖中雜質(zhì)的檢測

    天然藥物提取得到的多糖中常常含有蛋白質(zhì)類、核酸、單糖、色素、無機鹽等雜質(zhì),將多糖中的雜質(zhì)進行含量限定對多糖質(zhì)量控制有重要意義。

    4.1 多糖中蛋白質(zhì)的檢測

    常用于多糖中蛋白質(zhì)含量測定的方法有考馬斯亮藍法(Bradford法)、BCA法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外分光光度法、凱氏定氮法等。其中紫外分光光度法最為方便快捷,靈敏度較高,但是核酸類物質(zhì)對其測定有影響,可用于簡單的定性分析,樣品能夠回收。Bradford法和Lowry法的靈敏度最高,但操作相對較復雜,樣品不能回收。Chen等[50]采用Bradford法測定3種綠茶多糖中蛋白質(zhì)含量,采用胎牛血清作為標準物質(zhì),3種綠茶多糖(TPC-1、TCP-2、TCP-3)中蛋白質(zhì)含量分別為2.8%、3.8%和4.3%。Liu等[51]使用Lowry法測定一種蘑菇多糖中蛋白質(zhì)的含量,發(fā)現(xiàn)多糖中蛋白質(zhì)的含量對多糖抗氧化活性具有直接影響。李石軍等[52]使用紫外分光光度法檢測一種香菇多糖中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì),紫外掃描結(jié)果表明香菇多糖在260 nm和280 nm處無吸收峰,證明香菇多糖中不含蛋白質(zhì)。

    4.2 多糖中核酸的檢測

    核酸的常見測定方法有定磷法、紫外分光光度法、地衣酚法、二苯胺法等。紫外分光光度法是依據(jù)核酸在260 nm處有最大吸收值來測定多糖中核酸的量,一般認為在260 nm處無吸收峰即不含核酸。

    4.3 多糖中游離單糖檢測

    多糖中常常含有少量游離的單糖或寡糖,不經(jīng)過水解對多糖進行TLC、HPGPC或HPLC分析??蓹z測多糖中是否含有游離單糖。也可將多糖樣品采用乙醇沉淀,取上清測定樣品中游離單糖或寡糖的含量[53]。

    多糖中的色素雜質(zhì)一般經(jīng)過純化過程去除干凈,可肉眼觀察是否還有色素,高純度的多糖一般都是純白色或略帶黃色的固體粉末狀物質(zhì),色素含量較高時多糖呈現(xiàn)黑色或深黃色。除色素的方法常有活性炭吸附、大孔吸附樹脂、陰離子交換樹脂等方法。多糖中無機鹽雜質(zhì)一般是提取純化過程中引入的,比如酶解法除蛋白質(zhì)過程中引入的緩沖鹽。HPGPC色譜分析圖中可明顯觀察到多糖樣品中是否還有無機鹽。

    5 小結(jié)

    多糖是當前藥物研究的熱點,多糖質(zhì)量的穩(wěn)定可靠是保證期藥效實驗可信的重要前提。上述內(nèi)容就總糖含量測定方法、分子量大小和分布測定方法、單糖組成和摩爾比測定方法、雜質(zhì)檢測方法4個方面進行綜述,為多糖質(zhì)量控制方法研究提供參考和借鑒。但這些方法用于多糖質(zhì)量控制都存在一點的缺陷,多糖藥物的質(zhì)量控制需要2種或多種方法的相互結(jié)合。同時,更有快捷、有效的多糖質(zhì)量控制方法有待進一步尋找與發(fā)現(xiàn)。

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    (收稿日期:2014-11-09 本文編輯:蘇 暢)

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