細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1在缺氧后腦損傷中的表達(dá)模式

楊麗君++++++崔紅

[摘要] 目的 通過了解細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1（ERK-1）在缺氧腦損傷大鼠腦中的表達(dá)，了解其參與缺氧腦損傷的過程。 方法 48只3 d齡新生SD大鼠，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組和缺氧組，每組各24只，缺氧組SD大鼠置于自制密閉容器中，充以含8%氧氣的氧氮混合氣體，時(shí)間為90 min，對(duì)照組SD大鼠不進(jìn)行處理。分別于造模后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)——1、3、7、14、21 d和28 d后留取兩組SD大鼠腦組織，采用Western blot檢測(cè)ERK-1總蛋白在腦組織中的表達(dá)情況。 結(jié)果 缺氧組大鼠腦組織ERK-1呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)；變化規(guī)律：在缺氧早期（缺氧后1～7 d），ERK-1總蛋白的表達(dá)均有降低的趨勢(shì)，缺氧后第14天開始其表達(dá)具有升高的趨勢(shì)，缺氧后第21天和第28天ERK-1表達(dá)量又有所下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 缺氧造成新生大鼠腦損傷時(shí)，ERK-1總蛋白的表達(dá)譜沒有明顯變化的趨勢(shì)，提示在早產(chǎn)兒缺氧性腦損傷時(shí)ERK-1并不通過劑量的變化對(duì)缺氧后腦組織損傷進(jìn)行調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞] 早產(chǎn)兒；缺氧性腦損傷；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1；大鼠

[中圖分類號(hào)] R72 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（a）-0008-04

早產(chǎn)兒的存活率和生命質(zhì)量的改善是本世紀(jì)新生兒醫(yī)學(xué)重點(diǎn)攻克的目標(biāo)之一。據(jù)WHO報(bào)道，全球每年有1500萬(wàn)早產(chǎn)兒出生，且早產(chǎn)兒的發(fā)生率在逐年上升，我國(guó)人口眾多，每年出生的早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病數(shù)目更為驚人，在早產(chǎn)兒中常常會(huì)發(fā)生學(xué)習(xí)困難，表現(xiàn)為閱讀、拼寫、計(jì)算或?qū)懽骼щy。雖然近年來早產(chǎn)兒的預(yù)后有了很大的改善，但早產(chǎn)兒腦損傷所帶來的后遺癥等仍然是影響早產(chǎn)兒最終生命質(zhì)量的嚴(yán)重問題。迄今為止，早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1（extracellular signal regulated protein kinase 1，ERK-1）是所有絲裂原活化蛋白激酶家族最早被認(rèn)識(shí)的成員，有文獻(xiàn)報(bào)道，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的重要細(xì)胞信號(hào)通路[1]，近期有文獻(xiàn)報(bào)道，硫氫化鈉誘導(dǎo)的增殖也與ERK-1的磷酸化有關(guān)[2]。同時(shí)，ERK-1與凋亡也有比較密切的關(guān)系，有研究報(bào)道，其在腦缺血再灌注損傷發(fā)生過程發(fā)揮著重要作用[3-4]。近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道，其在缺氧/復(fù)氧損傷發(fā)生過程中也發(fā)揮非常重要的作用[5]。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)缺氧也能夠激活腎側(cè)群細(xì)胞的ERK的活性，但是在非側(cè)群細(xì)胞則不出現(xiàn)這種現(xiàn)象。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性因素刺激下，ERK-1參與了血腦屏障的Na+/H+交換以及Na+-K+-Cl-共運(yùn)輸?shù)倪^程[7]。也有研究認(rèn)為缺氧能夠在體外上調(diào)ERK-1的磷酸化[8]，但是ERK-1在缺氧性腦損傷發(fā)生之后的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜尚不明確，本研究擬在缺氧發(fā)生后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ERK-1的表達(dá)檢測(cè)，從而明確ERK-1在缺氧發(fā)生后的表達(dá)情況，從而更加有助于探討缺氧性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展以及神經(jīng)修復(fù)過程。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中用到的3 d齡SD大鼠（SPF級(jí)，雌雄不計(jì)，體重8～10 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2007-0001]，充入的氮氧混合氣體（8%O2+92%N2）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）提供，本實(shí)驗(yàn)室自制封閉容器。

1.2 缺氧模型的建立

實(shí)驗(yàn)所用到的3 d齡SPF級(jí)SD大鼠，日常在我院SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，條件如下，照明時(shí)間；黑暗時(shí)間=12 h∶12 h，溫度：23～25℃，濕度保持在40%。將乳鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組和缺氧組，每組各24只，對(duì)照組不做處理，缺氧組放入本實(shí)驗(yàn)室自制容器，在37℃水浴中充以氮氧混合氣（O2占8%），持續(xù)時(shí)間為90 min，之后回籠，繼續(xù)行母乳喂養(yǎng)。

1.3 大鼠腦組織標(biāo)本獲取

分別于缺氧模型建立后第1、3、7、14、21天和第28天6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死兩組大鼠，其中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和缺氧組大鼠各4只，每組大鼠的左側(cè)腦組織立即放入10%的中性福爾馬林溶液固定，之后進(jìn)行切片、備用，右側(cè)大腦立即放入液氮保存，用于進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.4 HE染色

將腦組織用10%的中性福爾馬林液中固定8 h，依次放入20%、30%蔗糖溶液分別過夜（24～48 h）沉底，組織沉底之后即可進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為12 μm，進(jìn)行HE染色，參見既往發(fā)表文章[9]，拍照保存。

1.5 Western blot檢測(cè)ERK-1表達(dá)量

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail（Roche）。按組織重量9倍比例加入裂解液，冰上用組織勻漿器進(jìn)行勻漿3次。冰上進(jìn)行孵育20 min后，4℃ 15 000 r/min離心20 min，取上清，分裝深低溫冰箱保存，按照BCA蛋白定量試劑盒（cwbiotech）測(cè)定蛋白濃度。之后進(jìn)行蛋白PAGE凝膠電泳，10%分離膠，5%濃縮膠（丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，TEMED，Amresco）。電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓130 V，通過預(yù)染蛋白Marker（Biomed）來確定電泳停止時(shí)間。濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流；0.45 μm孔徑PVDF膜（Millipore），轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。之后將膜完全浸沒TBST溶液中（含5%脫脂牛奶），室溫下?lián)u床孵育1 h。將膜與ERK-1一抗（Santa cruz）或者β-actin一抗（Santa cruz，封閉液稀釋）一起孵育，ERK-1的一抗稀釋濃度1∶500，β-actin的一抗稀釋濃度1∶1000，4℃冰箱過夜。次日TBST洗膜3次。二抗孵育：羊抗兔IgG HRP（1∶20 000），孵育40 min（在室溫），洗膜。滴加ECL，反應(yīng)3 min；曝光，顯影，定影。照相，用LabWorks軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，計(jì)算出每個(gè)樣本的ERK-1灰度值與相應(yīng)的β-actin的灰度值，取其比值進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠乳鼠缺氧后表現(xiàn)

缺氧后早期大鼠出現(xiàn)興奮癥狀的表現(xiàn)：躁動(dòng)不安、翻滾，呼吸加深加快，45 min～1 h后逐漸出現(xiàn)抑制癥狀：反應(yīng)遲緩淡漠、間斷發(fā)作的痙攣、抽搐等。最后進(jìn)入比較穩(wěn)定的反應(yīng)淡漠期，此反應(yīng)一直持續(xù)至缺氧完成，恢復(fù)氧供后乳鼠反應(yīng)逐漸恢復(fù)正常。

2.2 HE染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，海馬錐體細(xì)胞致密、完整，缺氧組大鼠海馬錐體細(xì)胞核淡染、甚至細(xì)胞核缺如，見圖1。

2.3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1表達(dá)情況比較

缺氧組ERK-1表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)性變化，與對(duì)照組相比，缺氧后ERK-1表達(dá)量基本處于低于正常對(duì)照的水平，但是與對(duì)照組的變化趨勢(shì)趨于一致，第14天時(shí)ERK-1的表達(dá)較對(duì)照組有所升高，到第21、28天時(shí)ERK-1的表達(dá)與對(duì)照組比較又有所降低。雖然有變化趨勢(shì)，但是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具體見表1，圖2、3。

3討論

缺氧性腦損傷的病理發(fā)生是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程，在此過程中，眾多分子參與其中，ERK-1蛋白在腦內(nèi)廣泛存在，是腦功能活動(dòng)中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[10]，ERK-1接受刺激信號(hào)后活化為磷酸化的ERK-1，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子等途徑發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。腦缺血再灌注損傷中有ERK-1廣泛參與，但其所發(fā)揮的是保護(hù)性作用還是損傷性作用，目前仍存在很大爭(zhēng)議[11-13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，自由基清除藥——依達(dá)拉奉可以通過激活ERK-1來減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中毒[14]。Ban等[15]的研究發(fā)現(xiàn)抑制ERK-1能夠惡化腸缺血/再灌注損傷。缺氧發(fā)生之后ERK-1的表達(dá)模式如何尚不明確，本研究通過探討缺氧發(fā)生后ERK-1的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式來進(jìn)一步明確缺氧發(fā)生過程中ERK-1的可能作用，研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后腦組織ERK-1表達(dá)水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，缺氧后第1天開始ERK-1表達(dá)降低，一直到缺氧后第7天達(dá)到表達(dá)的最低值，之后出現(xiàn)表達(dá)情況的上升，缺氧后第14天時(shí)表達(dá)高于正常情況，表達(dá)情況一直持續(xù)到缺氧后第21天達(dá)到最高峰，但是低于正常情況，缺氧后第28天時(shí)表達(dá)又有所降低。根據(jù)折線圖可以看出，ERK-1在大鼠乳鼠發(fā)育過程中呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)模式的表達(dá)情況，存在一個(gè)表達(dá)高峰和一個(gè)表達(dá)低谷，提示ERK-1在細(xì)胞的正常發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，缺氧組的ERK-1的表達(dá)總體比正常情況低下，雖然經(jīng)過分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是存在降低的趨勢(shì)，提示在大鼠乳鼠腦組織缺氧損傷過程中ERK-1也存在劑量的變化。需要進(jìn)一步研究ERK-1基因與其他缺氧相關(guān)的基因，如缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）等基因表達(dá)的相互關(guān)系，從而更加明確其參與缺氧腦損傷過程的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2014-10-15 本文編輯：任 念）