GFP-LC3B真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

朱杰，丁麗華，劉婕，禾榮華，張亞楠，陳志達(dá)，羅曉麗，葉棋濃，呂朝暉

1.解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

自噬（autophagy）是一種重要的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程，在多種基本的生物過(guò)程如生長(zhǎng)、衰老、死亡、防御疾病等方面起著關(guān)鍵的作用[1]。自噬過(guò)程始于擁有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬吞噬體的形成，自噬吞噬體成熟之后，與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體[2]，將胞質(zhì)內(nèi)的無(wú)關(guān)組分進(jìn)行消化、再利用。通過(guò)這種方式，不僅可以清除損壞的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1,3]，而且可以在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下重新動(dòng)員營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前，許多研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤的生長(zhǎng)中扮演著重要的角色[4]。

自噬這一過(guò)程主要通過(guò)一組高度保守的自噬相關(guān)蛋白（ATG蛋白）來(lái)調(diào)控。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在同源ATG蛋白[5]，如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtu?bule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3/LC3），它作為自噬溶酶體上的標(biāo)志蛋白，可以用來(lái)檢測(cè)自噬的發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn)，人類LC3存在3種亞型[7]，即LC3A、LC3B和LC3C，其中LC3B與自噬發(fā)生相關(guān)。自噬的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，在活細(xì)胞中，此過(guò)程可以用融合蛋白GFP-LC3B來(lái)監(jiān)測(cè)。正常情況下，LC3B在胞質(zhì)中呈均勻分布，發(fā)生自噬后，在倒置熒光顯微鏡下可見自噬小體的形成[8]。

本研究中，我們通過(guò)構(gòu)建人自噬相關(guān)基因LC3B的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-LC3B，用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3B融合蛋白的變化，動(dòng)態(tài)考察細(xì)胞的自噬過(guò)程，為進(jìn)一步研究自噬在腫瘤中的作用及發(fā)生機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

ZR75-1人乳腺癌細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本室保存；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；pEGFP-C1載體、PCR引物H91及H92由賽百勝公司合成；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ，pfu酶，dNTP混合物，T4DNA連接酶及DNA marker購(gòu)自Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素均為Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR回收試劑盒均購(gòu)自Promega公司；鼠抗GFP單克隆抗體購(gòu)自Chemicon公司；GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 pEGFP-C1-LC3B真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以乳腺文庫(kù)為模板，根據(jù)人LC3序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的上游引物（5'-CGGAATTCTATGCCGTC GGAGAAGACCTTC-3'）和下游引物（5'-GGGGTAC CTTACACTGACAATTTCATCC-3'），用 pfu 酶 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增（95℃變性1 min；95℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)29個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min），擴(kuò)增片段大小為383 bp；切下膠回收條帶，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pEGFP-C1空載體于37℃用EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切4 h，電泳切膠回收酶切產(chǎn)物；用T4DNA連接酶連接8 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；次日挑取平板上的單菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h，提取質(zhì)粒，用PCR及EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定；對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒再進(jìn)行質(zhì)粒序列測(cè)定，并用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與NCBI中所公布的LC3序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 Western印跡鑒定

將ZR75-1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至70%左右時(shí)用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LC3B及對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-C1，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后更換為DMEM正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸15 min，離心后取15～20 mg上清蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的GFP（1∶1000）抗體或GAPDH（1∶1000）抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影，掃描圖像并保存。

1.4 倒置熒光顯微鏡觀察GFP-LC3B的表達(dá)

將ZR75-1細(xì)胞接種于6孔板中，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（每組均含復(fù)孔），待密度為70%左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均分別用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LC3B及對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-C1，4 h后換為DMEM正常培養(yǎng)基，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別將1 mol/L雷帕霉素按1∶1000加于2組的復(fù)孔中，觀察綠色熒光聚體的形成。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-C1-LC3B真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增得到約400 bp的LC3B全長(zhǎng)基因，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。將擴(kuò)增的LC3B全長(zhǎng)序列及pEGFP-C1空載體同時(shí)用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切處理，酶切產(chǎn)物與空載體連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果顯示在約400 bp處出現(xiàn)特異條帶，而對(duì)照空載體pEGFP-C1無(wú)此特異條帶（圖2）；DNA測(cè)序結(jié)果顯示人LC3B基因序列成功插入載體（數(shù)據(jù)略）。以上結(jié)果表明pEGFPC1-LC3B真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 檢測(cè)GFP-LC3B融合蛋白的表達(dá)

圖1 目的基因LC3B的PCR擴(kuò)增M：DNA marker DL2000；1：退火溫度為58℃時(shí)的PCR產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒的EcoRⅠ/KpnⅠ酶切鑒定M：DNA marker DL2000；1：pEGFP-C1空載體；2：pEGFP-C1-LC3B

將上述陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LC3B，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空載體，24 h后收細(xì)胞通過(guò)Western印跡檢測(cè)LC3B的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LC3B重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為43×103的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空載體的對(duì)照組表達(dá)的特異性條帶相對(duì)分子質(zhì)量為27×103（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符，表明GFP-LC3B融合蛋白在ZR75-1細(xì)胞中表達(dá)成功。

2.3 倒置熒光顯微鏡觀察GFP-LC3B的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LC3B和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3B的實(shí)驗(yàn)組和穩(wěn)定表達(dá)GFP的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的復(fù)孔均用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素刺激，在熒光顯微鏡下觀察（×20），轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LC3B的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理后，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光聚集體，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的對(duì)照組在雷帕霉素處理前后，胞質(zhì)中的綠色熒光蛋白分布均勻（圖4）。

3 討論

自噬是一種進(jìn)化上高度保守的膜加工過(guò)程[9]，其發(fā)生包括雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡-自噬吞噬體的形成，它可以吞沒(méi)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞內(nèi)容物，將它們運(yùn)輸至溶酶體結(jié)合以至降解[1]。通過(guò)降解，自噬使有缺陷的細(xì)胞器、折疊或聚集的蛋白質(zhì)以及長(zhǎng)期存在的大分子物質(zhì)得到更新，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用。除此之外，腫瘤形成、細(xì)胞死亡等過(guò)程也會(huì)受到自噬的影響[10]。自噬在腫瘤中的作用是一把雙刃劍：一方面，自噬通過(guò)移除被損壞的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)以及保護(hù)基因組的穩(wěn)定性來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，自噬已經(jīng)被證實(shí)在腫瘤微環(huán)境中會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[11-14]。鑒于自噬在惡性疾病中的雙重角色[15]，調(diào)整自噬在腫瘤治療中發(fā)揮的作用是非常必要的，且有待進(jìn)一步深入研究[16-17]，以便于充分利用自噬在腫瘤中的抑制作用，降低其在腫瘤中的促進(jìn)作用。

圖3 Western印跡檢測(cè)GFP及GFP-LC3B的表達(dá)1：轉(zhuǎn)染pEGFP-C1對(duì)照載體；2：轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LC3B

圖4 熒光顯微鏡觀察LC3B在ZR75-1細(xì)胞中的自噬泡形成（×20）箭頭示自噬小體位置

自噬是一個(gè)由一系列自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)完成的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中ATG8家族蛋白是自噬溶酶體發(fā)揮作用的關(guān)鍵蛋白。LC3B是哺乳動(dòng)物中被廣泛研究的ATG8家族分子，既可以水溶性的LC3B-Ⅰ存在，也可以脂溶性的LC3B-Ⅱ存在[18]。正常情況下，胞內(nèi)合成的LC3B以水溶性的LC3B-Ⅰ存在，在壓力、饑餓等應(yīng)激狀態(tài)下，LC3B-Ⅰ與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合形成LC3B-Ⅱ并聚集到自噬體膜上，使LC3B-Ⅱ的含量上調(diào)，因此LC3B-Ⅱ的含量可以反映自噬泡數(shù)量[18]，LC3B-Ⅱ被作為自噬體的標(biāo)志分子并廣泛用于自噬的相關(guān)研究。

本研究成功構(gòu)建了帶GFP標(biāo)簽的人LC3B重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至ZR75-1細(xì)胞中，表達(dá)GFP與LC3B的融合蛋白。正常情況下，可見到胞質(zhì)中均勻分布的綠色熒光蛋白，而在自噬發(fā)生后，可以觀測(cè)到呈點(diǎn)狀分布的自噬小體的形成。因此，可以應(yīng)用熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)自噬的發(fā)生，這為進(jìn)一步研究自噬在腫瘤細(xì)胞中的發(fā)生以及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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