三種李斯特菌菌體蛋白提取方法的比較

徐宗凱 林青青 周夢瑩 劉思靜 黃耀 李文熙 李興橋 余倩 汪川

摘要：通過對3種李斯特菌菌體蛋白提取方法主要是破壁方式的比較，找到一種可高效提取李斯特菌菌體蛋白的方法，為該菌的深入研究提供可靠技術。以綿羊李斯特菌新鮮液體培養(yǎng)物為材料，收集菌沉淀，分別選用3種破壁方式破除細胞壁，三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）-丙嗣沉淀法沉淀破壁液中的菌體蛋白，采用聚丙稀酰氨凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western-blot分析所得菌體蛋白。溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法提取得到的李斯特菌菌體蛋白SDS-PAGE條帶清晰豐富，Western-blot條帶特異。溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法可有效提取李斯特菌菌體蛋白，滿足常用蛋白分析技術的要求，是一種提取李斯特菌菌體蛋白的可靠方法。

關鍵詞：李斯特菌；蛋白質；提取；超聲破壁

中圖分類號：Q71 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0029-05

ComparisonofThreeMethodsforExtractionofNon—secretedProteinsfromListeria

XUZong-kai，LINQing-qing，ZHOUMeng-ying，LIUSi-jing，HUANGYao，LIWen-xi，LIXing-qiao，YUQian，WANGChuan

（DepartmentofPublicHealthLaboratorySciences，WestChinaSchoolofPublicHealth，SichuanUniversity，Chengdu610041，Sichuan，China）

Abstract：Threemethodsofextractingnon-secretedproteinsfromListeriawerecompared，mainlydifferentinlysisprocess，toobtainanefficientnon-secretedproteinsextractingmethodforListeria，toprovideareli?abletechniqueforthefurtherstudyofListeria.FreshbrothcultureofListeriaivanoviiwasusedasstudymaterial.Bacteriadepositwascollectedbycentrifugation，andthreelysingapproacheswereadoptedsepa?rately.Non-secretedproteinswereobtainedthroughthemethodoftrichloroaceticacid（TCA）-acetonepre?cipitationinthelysissolution，andverifiedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）andWestern-blot.SDS-PAGEbandsofnon-secretedproteinsextractedviathemethodof1ysozyme-ultrasonication-TCA-acetoneprecipitationweredistinctandsufficient，andtheWestern-blotre?sultswerespecific.Themethodoflysozyme—ultrasonication—TCA—acetoneprecipitationcanbeusedtoex?tractListerianon-secretedproteinsefficiently，whichisqualifiedforcommonproteinexperiments，andisareliablemethodforextractingnon-secretedproteinsfromListeria.

Keywords：Listeria；protein；extraction；ultrasonication

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：029-033）

李斯特菌是一類革蘭陽性無芽孢桿菌，包括單增李斯特菌U—monocytogenes，LM）、綿羊李斯特菌（Livanovii，LI）等7個菌種，具有獨特的胞內(nèi)增殖規(guī)律：進入胞內(nèi)，逃逸胞吞泡，在細胞漿內(nèi)增殖，以細胞-細胞的傳播方式擴大感染細胞范圍[1、2]。李斯特菌在吞噬細胞等抗原遞呈細胞胞漿內(nèi)增殖的生物學特點，是該菌誘導機體產(chǎn)生特異性T細胞免疫應答的最主要因素，也是其作為T細胞免疫應答研究工具的生物學基礎[3、4]。由于李斯特菌能誘導機體特異性細胞免疫應答，使得該菌被越來越多地用于減毒活菌載體重組疫苗的構建[5-7]：在構建以李斯特菌為載體的重組疫苗研究中，重組菌蛋白質表達的驗證是關鍵的一步.同時研究者還需了解目的蛋白是存在于菌體內(nèi)還是分泌到胞外。目前發(fā)表的文獻中，尚未查到成熟的、重復性好，且適用于李斯特菌菌體蛋白的提取方法。本研究采用幾種方法分別提取李斯特菌菌體蛋白，然后用SDS-PAGE電泳及Westernblot進行檢測，希望能為該菌的深入研究提供一種獲取菌體蛋白的可靠手段。

1材料與方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件

綿羊李斯特菌野生株（LI）和重組株LI-HA（能分泌表達帶HA抗原標簽的結核桿菌Ag85C蛋白，約43kD），單增李斯特菌重組株LM-0VA（能分泌表達帶HA抗原標簽的卵白蛋白，約35kD），由四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫系實驗室提供。所有菌株均用腦心浸液培養(yǎng)基（brianheartinfusion，BHI）于37℃培養(yǎng)。

1.2主要試劑及儀器

HA-單克隆抗體、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預染蛋白質相對分子質量標準、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、考馬斯亮藍染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），三氯乙酸（TCA）（美國Sigma公司），β-巰基乙醇、0.1%（W/V）溴酚藍（美國Amresco公司）、HRP化學發(fā)光底物顯色反應液（美國ThermoFisher公司），PVDF膜（美國Millipore公司），超聲破碎儀（美國S0N-ICS公司），低溫局速離心機（美國ThermoFisher公司），TS-A型脫色搖床（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠），分光光度計（美國Unico公司），PAGE垂直電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司），DY-CZ-40D型轉移電泳槽（北京六一儀器廠），Chemi-DocXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），DYY-DI2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），恒溫氣浴搖床（美國ThermoFisher公司）。

1.3主要試劑的配制

1.3.1重懸液

稱取1g蔗糖和10mg溶菌酶，溶解于3.7mLddH2O，加入0.5mL0.1mol/LPBSpH7.0，濾過除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.2裂解液1

取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，6mL10%SDS溶液，加ddH2O至10mL，濾過除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.3裂解液2

取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，60μL0.5mol/LEDTApH8.0溶液，6mL10%（W/V）SDS溶液，10mg/mL蛋白酶K，加ddH2O至10mL，濾過除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.4蛋白溶解液

稱取4gSDS粉末，溶解于10mL0.5mol/LTris-HClpH8.0溶液，濾過除菌，分裝，-20℃保存：

1.3.52xloading buffer

加入2.5mL0.5mol/LTris-HClpH6.8、2mL甘油、4mL10%（W/V）SDS，0.5mL0.1%（W/V）溴酚藍，用ddH20定容至10mL，分裝，-20℃保存，臨用時加入β-琉基乙醇至終濃度為5%。

1.3.6TBST

稱取3.52gNaCl，加入4mL1mol/LTris-HClpH7.5，純水定容至400mL，然后加入0.2mLTween-20。

1.3.7封閉液

稱取1.5g脫脂奶粉，用TBST30mL溶解。

1.4細菌菌體蛋白樣品提取

1.4.1溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法

將細菌接種5mLBHI肉湯，37°C200r/min搖育過夜，取500μL增菌液轉移至另一支10mLBHI肉湯中，37°C200r/min搖育，以BHI肉湯為空白調(diào)零，測定細菌培養(yǎng)液當OD600，當OD600≈0.8時，取5mL菌液，13000r/min離心2min，棄上清，加入2mL無菌PBS，13000r/min離心2min，棄上清，加入300μL重懸液，吹打使菌體重懸，37℃水浴2h，加人300μL裂解液1，37℃水浴30min，加入500μL4℃預冷的飽和三氯乙酸（500g三氯乙酸用227mL純水溶解），冰浴45min，4℃13000r/min離心30min，棄上清。加入已于-20℃預冷的丙酮20mL，4℃13000r/min離心10min，棄上清，加入100μL蛋白溶解液溶解沉淀，將溶液轉移至EP管，加入等體積2xloading buffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。

1.4.2溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法

細菌培養(yǎng)和收集步驟同上，加人重懸液37℃水浴2h后，加入300μL裂解液2，37℃水浴30min，加入500μL4℃預冷的飽和三氯乙酸，后續(xù)步驟同上。

1.4.3溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法

細菌培養(yǎng)和收集步驟同上，加入重懸液37℃水浴2h后，加入5mL無菌水，超聲波破碎菌體細胞（振幅100%，脈沖5s，停歇5s，總共脈沖4min），加入500μL4℃預冷的飽和三氯乙酸，后續(xù)步驟同上。

1.5細菌分泌蛋白樣品提取

細菌接種5mLBHI肉湯，37V200r/min搖育過夜，將5mL增菌液轉移至60mLBHI肉湯中，37℃200r/min搖育，以BHI肉湯為空白調(diào)零，測定細菌培養(yǎng)液OD600，當OD600≈1時，取40mL菌液于13000r/min離心2min，取上清液35mL置于50mL離心管中，加入3.5mL4℃預冷的飽和氯乙酸，冰浴30min后，413000r/min離心30min，棄上清，加入已-20℃預冷的丙酮20mL，4℃13000r/min離心10min，棄上清。加入100蛋白溶解液溶解沉淀，將溶液轉移至EP管，加入等體積2xloadingbuffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。

1.6SDS-PAGE檢測

按試劑盒說明書配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量10μL平行上樣，濃縮電壓80V，分離電壓120V，電泳1.5h，考馬斯亮藍染色，脫色至背景清晰。

1.7Western-blot

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，恒流200mA轉PVDF膜1.5h，將膜于30mL封閉液中，20℃搖床上封閉1h，將膜置于30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，加入用TBST稀釋的HA單抗（1：5000）10mL，4℃孵育過夜，將膜置入30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，重復3次，加入用TBST稀釋的二抗（HRP標記羊抗鼠IgG）（1：1000）10mL20℃孵育1h，將膜置入30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，重復3次，將HRP化學發(fā)光底物顯色反應液滴加于膜表面，ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2結果

2.1SDS-PAGE檢測結果

圖1可見，溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌體蛋白只能在小于19KD處見到一明顯條帶，其余位置僅可見少量極淡條帶，豐度和清晰度皆不夠。圖2可見，溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-內(nèi)酮沉淀法提取的李斯特菌菌體蛋白僅能在約35kD處見到明顯條帶，其余條帶幾乎不可見。圖3可見，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌菌體蛋白，電泳條帶豐度較高，條帶清晰。圖4可見，TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌分泌蛋白，電泳條帶較清晰，豐度較高。

以上結果表明，溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌體蛋內(nèi)質豐度最高

2.2Western-blot檢測結果

圖5可見，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA菌體蛋白在約43kD處有清晰條帶，LM-OVA菌體蛋白（菌體蛋白陰性對照）及LI菌體蛋白（菌體蛋白陰性對照）均無條帶。圖6可見，TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA分泌蛋白在約43kD處有清晰條帶，LM-0VA分泌蛋白（分泌蛋白陽性對照）在約35kD處有清晰條帶，LI分泌蛋白（陰性對照）無條帶。

3討論

以李斯特菌為載體的重組疫苗是當前T細胞免疫疫苗的一個研究熱點，對該類型疫苗免疫學價值的研究需要以重組抗原的良好表達作為前提，常用的Western-Wot法和SDS-PAGE法都建立在成功從李斯特菌中提取蛋白的基礎之上。根據(jù)細菌生長曲線，當細菌處于生長對數(shù)期，即將進入穩(wěn)定期（OD600≈0.8）時，此時細菌數(shù)量基本已至最大，且對外界環(huán)境因素的影響最敏感，最適于提取菌體蛋白，而當細菌完全進入穩(wěn)定期后（OD600≈1.0），此時積累大量分泌蛋白，適于提取。

細菌分泌蛋白主要存在于培養(yǎng)物的上清液中，可以通過TCA-丙酮沉淀的方法收集。菌體蛋白的提取需要充分裂解李斯特菌，釋放胞內(nèi)蛋白。由于李斯特菌屬于革蘭陽性菌，細胞壁厚，常規(guī)方法不易破壁，故作為本研究的重點。

常用裂解細菌的方法有機械法、化學法和酶法[8]。本研究中分別采用了SDS、蛋白酶K和超聲破碎結合溶菌酶的破膜方式。溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法對李斯特菌的裂解效果不理想，蛋白釋放不完全，結果中小于19kD處的條帶疑似為溶菌酶（約14kD）條帶；溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法由于蛋白酶K水解作用具有高

效的酶活性和底物廣譜性，對細菌所有蛋白都有降解作用，故只在約35kD處出現(xiàn)一條疑似蛋白酶K（約30kD）的條帶。上述兩種方法均不能滿足分析李斯特菌菌體蛋白的要求，而經(jīng)本研究證實，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法能夠有效地裂解李斯特菌，充分釋放細菌細胞內(nèi)蛋白并保證蛋白質完整性。

根據(jù)LM-OVA菌體蛋白與分泌蛋白West-ern-hlot結果分析可知，該種將細菌培養(yǎng)物先離心后再取沉淀提取菌體蛋白的方法，可有效避免細菌分泌蛋白的干擾，從而對細菌蛋白表達方式的研究具有一定的意義。

溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法具有操作簡單、耗時短、成本低、不引入干擾物質等特點，能夠滿足對李斯特菌蛋白的SDS-PAGE和West-ern-hlot分析的要求。分析3種方法，可認為其中超聲破碎起主要作用[9-12]。值得注意的是，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法中超聲強度尤為重要，可根據(jù)具體的樣品量和儀器進行適當調(diào)整，超聲強度一般控制在略低于產(chǎn)生泡沫的水平。在超聲破碎的過程中需要將樣品置于冰上，避免超聲產(chǎn)生的高溫使蛋白質變性；并適當調(diào)整探頭位置，避免產(chǎn)生泡沫。

本研究中的李斯特菌菌體蛋白提取方法一次可收集蛋白約100μL，足夠進行多次SDS-PAGE或Westmi-blot分析。該方法易受TCA濃度的影響，故實驗過程中應嚴格控制飽和TCA加入量為反應總體積的10%。其次，蛋白質充分釋放后應保證操作全程低溫，避免蛋白質變性或降解。

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