小鼠卵巢幾個(gè)重要發(fā)育事件的初步研究

羅陽(yáng) 李莉 林戈

摘要：選定多個(gè)階段小鼠卵巢進(jìn)行切片染色和生殖細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)等分析，以發(fā)現(xiàn)該階段小鼠卵巢的發(fā)育特點(diǎn)結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育第12.5d的生殖嵴中，大部分的生殖細(xì)胞正進(jìn)行有絲分裂增殖，并以生殖包囊的形式存在；在出生后第2d的小鼠卵巢中，有大量緊密接觸的原始卵泡，表明生殖包囊剛完成重組形成原始卵泡；在第5d的小鼠卵巢中，原始卵泡仍占有大部分比例，但也有大量的初級(jí)卵泡處于發(fā)育之中；在出生后第10d的卵巢中同時(shí)有原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的發(fā)育；老年小鼠（16個(gè)月大）卵巢中已基本沒(méi)有卵母細(xì)胞.，

關(guān)鍵詞：卵巢發(fā)育；生殖嵴；生殖包囊；卵泡

中圖分類號(hào)：Q418；Q95-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)=1007-7847（2015）01-0044-05

PreliminaryStudiesofSeveralImportantDevelopmentalEventsinMouseOvary

LUOYang1，LILi1，LINGe2*

（1.CenterforReproductiveMedicine，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity；KeyLaboratoryforRepro?ductiveMedicineofGuangdongProvince，Guangzhou510150，Guangdong，China；InstituteofReproductiveandStemCellEngineering，CentralSouthUniversity，ChangshaReproductiveandGeneticHospitalofCitic-Xiangya，Changsha410078，Hunan，China）

Abstract：Ovariesfrommiceatselectedstageswerestainingandcountingstatistics，todiscovertheirdevelo?pmentalcharacteristics.Theresultsindicatedthatmostofthegermcellswereproliferatingandexistingintheformofgermcystsinfemalegonadofembryodays12.5；Theday2ovarieshadmanyadjacentandclosedcontactedprimordialfollicles，whichindicatedthatthegermcellcystsjustcompletedtheprogrammedbreakdowntoformprimordialfollicles；Intheday5ovaries，therewerealargenumberofprimaryfollicles，hutprimordialfolliclesstilloccupiedmostly；Theday10ovarieshadthedevelopingprimordial，primaryandsecondaryfolliclesatthesametime；Theagedmouseovaries（16monthsold）almostpossessednooocytes.

Keywords：ovariandevelopment；genitalridge；germ

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：044?048）

由于哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育的保守性，人類卵巢發(fā)育的許多線索通常是先通過(guò)對(duì)小鼠卵巢發(fā)育的研究來(lái)獲得的[1-3]。本文通過(guò)對(duì)基本貫穿小鼠生命周期的幾個(gè)卵巢發(fā)育重要事件的研究，為小鼠卵巢發(fā)育乃至人類卵巢的相關(guān)研究提供一定的借鑒。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57bl/6j小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司（中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心湖南分中心）。小鼠飼養(yǎng)條件為恒定溫度下，12h的光照和12h的黑暗，提供充足的水和動(dòng)物飼料；

孕鼠的獲得：適育年齡的母鼠（8周左右），于下午2點(diǎn)左右進(jìn)行孕馬血清血促性素注射，48h后進(jìn)行絨促性素注射，然后與適育年齡的公鼠（10周左右）以2：1進(jìn)行同籠，次日早晨進(jìn)行檢栓，見栓小鼠以當(dāng)日中午起記為第0.5d。所有小鼠的處死均采用頸椎脫位法殺死。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

注射用血促性素（孕馬血清）和注射用絨促性素由浙江杭州動(dòng)物藥品廠提供；DPBS（Dulbeccosphosphate-bufferedsaline）、胎牛血清、Edu及相應(yīng)檢測(cè)試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供；生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記MVH多克隆抗體及相應(yīng)二抗由美國(guó)R&D公司提供；體視顯微鏡（SM2645）、倒置顯微鏡（TE300）以及免疫突光顯微鏡由日本Nikon公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1胚胎期第12.5d（E12.5）生殖嵴組織的取材及石蠟包埋

E12.5生殖嵴組織的取材為懷孕第12.5d的母鼠處死后，剝離取出胚胎置于100mm皿中，于體視鏡下解剖取雌性生殖嵴組織。由于E12.5的生殖嵴組織需要進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，故需要在處死前進(jìn)行Edu注射。具體方法為對(duì)懷孕第12.5d的孕鼠注射Edu溶液，3h后進(jìn)行第2次注射，待3h后進(jìn)行處死取材。

小鼠胚胎浸潤(rùn)于冰冷（4℃）DPBS中，洗滌去除血污，用細(xì)剪刀自上肢下方處剪除去掉胚胎的上部組織，保留下半部分胚胎；以鐘表鑷沿下半部胚胎的腹部中間夾開，挑出腹部的肝臟和腸子等雜質(zhì)組織，后轉(zhuǎn)至另一潔凈的操作皿中，用冰冷DPBS沖洗干凈后，用鐘表鑷輕柔地固定胚胎兩側(cè)，分離挑出胚胎體腹后壁兩側(cè)的雌性生殖嵴組織。鏡下可從組織形態(tài)區(qū)別生殖嵴組織的性別：雄性生殖嵴組織相對(duì)粗而短，可見有分布于組織中的條紋；雌性生殖嵴組織相對(duì)細(xì)而長(zhǎng)，可見有分布于組織中的斑點(diǎn)存在[4、5]。

取出的生殖嵴組織直接投入含有4%多聚甲醛的1.5mL的EP管中進(jìn)行固定，置于4℃固定過(guò)夜。第二天用鑷子取出固定好的生殖嵴組織，以包埋紙包裹好組織，然后進(jìn)行組織石蠟包埋。

1.3.2第2d、5d、10d及老年期小鼠卵巢石蠟組織的制備

分別取出生后第2d、5d、10d小鼠，處死后，于顯微鏡下取出其卵巢組織，取出的卵巢組織以4%多聚甲醛固定，4℃過(guò)夜。第二天進(jìn)行組織石蠟包埋。

由于老年小鼠卵巢組織需要進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，故需要在處死前進(jìn)行Edu注射，具體方法同E12.5生殖嵴組織中操作。老年小鼠處死后，取出其卵巢組織，4℃固定過(guò)夜。第二天進(jìn)行組織石蠟包埋。

1.3.3卵巢石蠟組織切片Edu免疫熒光染色及檢測(cè)

Edu染色作為一種檢測(cè)細(xì)胞有絲分裂的簡(jiǎn)便和有效方式，廣泛用于細(xì)胞增殖的檢測(cè)研究[6]。本研究中通過(guò)對(duì)活體小鼠進(jìn)行Edu注射后，取其卵巢組織進(jìn)行免疫熒光染色，以檢測(cè)研究組織細(xì)胞的增殖狀況。

制備的石蠟組織行4pm切片，然后進(jìn)行抗原修復(fù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)配置Edu染色液，吹打混勻后，避光反應(yīng)30min，吸去反應(yīng)液后，可直接于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察或繼續(xù)進(jìn)行其他免疫熒光染色

1.3.4卵巢石蠟組織切片MVH免疫焚光染色及檢測(cè)

是僅特異性表達(dá)于生殖細(xì)胞中的基因，其在小鼠中同系基因?yàn)镸VH（mouseVasahomo-logue，MVH）[7、8]。本實(shí)驗(yàn)中，將MVH作為生殖細(xì)胞的檢測(cè)標(biāo)記。

制備的石蠟組織行4μm切片，抗原修復(fù)后，胎牛血清封閉液封閉處理30min，吸去封閉液，加入以封閉液稀釋的一抗MVH，濃度為8mg/L，置于4℃下孵育過(guò)夜；第二天，取出孵育的切片，于室溫下復(fù)溫30min，然后漂洗液漂洗5minx2次，加入稀釋過(guò)的熒光二抗（1：1000），室溫下避光孵育1h，吸去二抗，以漂洗液漂洗10minx3次，加入Dapi，避光10min，吸去Dapi，漂洗5minx2次后，于熒光顯微鏡下進(jìn)行免疫熒光觀察

1.3.5組織學(xué)觀察和評(píng)價(jià)

將實(shí)驗(yàn)中的卵巢組織進(jìn)行石蠟包埋和切片，HE染色后于高倍鏡下進(jìn)行評(píng)價(jià)和計(jì)數(shù)分析。卵泡分析參照Tilly等運(yùn)用的標(biāo)準(zhǔn)，即由單層扁平的小顆粒細(xì)胞包繞著初級(jí)卵母細(xì)胞時(shí)稱之為原始卵泡[1、9]；由單層立方柱狀顆粒細(xì)胞包繞初級(jí)卵母細(xì)胞時(shí)為初級(jí)卵泡；多于兩層少于四層立方狀顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞的卵泡為次級(jí)卵泡。

1.3.6數(shù)據(jù)分析處理

計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1生殖嵴期時(shí)的生殖細(xì)胞増殖事件

我們對(duì)懷孕第12.5d時(shí)的母鼠進(jìn)行Edu活體注射后處死，解剖分離出胎鼠的生殖嵴組織，發(fā)現(xiàn)不同性別胎鼠的生殖嵴組織巳有較明顯的組織學(xué)區(qū)別。雄性生殖嵴可見彎曲管狀結(jié)構(gòu)，而雌性則出現(xiàn)斑點(diǎn)狀特點(diǎn)（圖1）：對(duì)分離得到的雌性生殖嵴組織進(jìn)行免疫熒光染色（EDUWMVH免疫熒光染色）（圖2），發(fā)現(xiàn)大量的生殖細(xì)胞（圖2A）處于有絲分裂狀態(tài)（圖2B），經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)雌性小鼠中處于增殖狀態(tài)的生殖細(xì)胞比例為83.14±5.2%（MVH與EDU雙陽(yáng)性細(xì)胞占MVH陽(yáng)性細(xì)胞的比例。（圖2C），故可認(rèn)為此生殖嵴期的組織中有大部分生殖細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。

2.2生殖包囊細(xì)胞重組形成卵泡事件

在出生后2d的小鼠卵巢組織中，基本上已見不到生殖嵴組織中那樣的生殖包囊，MVH染色發(fā)現(xiàn)大部分生殖細(xì)胞都呈現(xiàn)有完整邊界的獨(dú)立形態(tài)，但可見有較多的位置相鄰較近的原始卵泡；而且相較于生殖嵴期，2d時(shí)卵巢組織的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化我們推測(cè)該時(shí)期剛由上個(gè)發(fā)育階段中的生殖包囊完成重組形成原始生殖細(xì)胞。

對(duì)生殖包囊狀況進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)后，發(fā)現(xiàn)生殖嵴期組織中的生殖細(xì)胞絕大部分都是以生殖包囊的形式存在，而在出生后2d小鼠卵巢組織中，則都是形態(tài)上獨(dú)立存在的原始卵泡（表1）。

2.3卵泡發(fā)育事件

在出生5d后的小鼠的卵巢組織中，生殖細(xì)胞較為均勻地分布于整個(gè)組織中，大部分都是形態(tài)是卵圓形的小卵泡（圖3）；而在10d的小鼠卵巢中，則可見有許多卵圓形的小卵泡位于組織皮層，但由組織外緣向深處也存在有較多發(fā)育相對(duì)史'為成熟的大卵泡（圖4）。經(jīng)計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，2d小鼠卵巢中卵泡均為原始卵泡；到5d時(shí)，原始卵泡比例有了明顯下降，但仍占據(jù)主要部分，此時(shí)出現(xiàn)了較多的初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡此時(shí)非常少；而在10d的卵巢中，原始卵泡的比例繼續(xù)顯著減少，而初級(jí)卵泡比例在上升，且此時(shí)出現(xiàn)了較多的次級(jí)卵泡（圖5）。

2.4卵泡耗竭與卵巢衰老事件

我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠（16個(gè)月大?。┥砘顒?dòng)遲鈍，毛發(fā)泛白且雜亂，同籠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該年齡的小鼠已不具備生育能力。卵泡計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，老年小鼠卵巢中的生殖細(xì)胞數(shù)目已非常少，表明卵巢生殖細(xì)胞儲(chǔ)備基本耗盡（圖6A，D）；同時(shí)，卵巢中處于增殖狀態(tài)的體細(xì)胞也很少（圖6B）。這表明該老年小鼠的卵巢已完全衰老，不能發(fā)揮相應(yīng)功能。

3討論

實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)生殖嵴期組織處于活躍的增殖狀態(tài)，由于生殖細(xì)胞的增殖活動(dòng)僅在該期進(jìn)行，所以該階段生殖細(xì)胞的增殖影響著卵巢中卵子所能達(dá)到的最大數(shù)目。

同時(shí)生殖嵴期時(shí)候生殖細(xì)胞大多以包囊形式存在，而在2日齡小鼠卵巢中，基本上均為形態(tài)獨(dú)立的卵泡細(xì)胞，表明小鼠出生前后卵巢組織中會(huì)發(fā)生大的形態(tài)變化，生殖包囊解體，與周圍體細(xì)胞重組形成卵泡。生殖細(xì)胞的數(shù)量與前階段也有一個(gè)顯著的下降，并且形成的卵泡構(gòu)成了卵巢中的卵泡儲(chǔ)備。至于在生殖包囊解體形成單個(gè)卵泡的過(guò)程中如何進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)的交流和細(xì)胞器的分配，以及這些活動(dòng)對(duì)生殖細(xì)胞的影響則有待進(jìn)一步研究[10、11]。

在2日齡小鼠卵巢中的卵泡基本上均為原始卵泡，到第5日齡卵巢中時(shí)，卵巢中出現(xiàn)一定數(shù)量的初級(jí)卵泡和少量的次級(jí)卵泡，到第10日齡時(shí)候，原始卵泡的數(shù)量顯著減少，而初級(jí)卵泡比例在上升，此時(shí)也出現(xiàn)了較多的次級(jí)卵泡。且可見原始卵泡均集中于卵巢邊緣，而初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡則由皮質(zhì)向髓質(zhì)呈指向分布，由此可以推測(cè)卵泡的發(fā)育存在一定的路徑選擇。

卵泡由原始卵泡募集進(jìn)入發(fā)育直至排卵，直到卵泡儲(chǔ)備耗竭，表現(xiàn)為卵巢衰老，喪失生殖能力。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠卵巢中已無(wú)法見到生殖細(xì)胞，且體細(xì)胞的增殖活動(dòng)也處于微弱狀態(tài)[12]。

E12.5時(shí)的生殖嵴中，有大部分的生殖細(xì)胞正進(jìn)行增殖，并以生殖包囊的形式存在；在出生后第2d的小鼠卵巢中，有著大量位置相鄰、接觸緊密的原始卵泡，表明生殖包囊剛完成重組形成了原始卵泡；在第5d的小鼠卵巢中，原始卵泡仍占有大部分比例，但也有大量的初級(jí)卵泡處于發(fā)育之中；在出生后第10d的卵巢中同時(shí)具有原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的發(fā)育；而老年小鼠（16個(gè)月大?。┑穆殉仓幸鸦緵](méi)有卵母細(xì)胞；且其體細(xì)胞的增殖活動(dòng)也處于非常微弱的水平，在實(shí)際中，該時(shí)間段的小鼠喪失了生殖能力，并表現(xiàn)出明顯的衰老特征。

我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)描述了小鼠卵巢幾個(gè)重要時(shí)期的發(fā)育事件特征，為后續(xù)的深入研究打下基礎(chǔ)。

[1]JOHNSON J， CANNING J， KANEKO T， et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary fJ].Nature， 2004， 428（6979）： 145-150.

[2]ZOU K， YUAN Z， YANG Z， et al. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries[J]. Na?ture Cell Biology， 2009， 11（5）：631-636.

[3]羅陽(yáng)，林戈.哺乳動(dòng)物卵巢中生殖干細(xì)胞的研究歷史與進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究（LUO Yang，LIN Ge. Germ stem cells in the mammalian ovary — history and recent progress[J]. Life Science Research）， 2012， 16（l）：85-89.

[4]MOLYNEAUX K A， STALLOCK J， SCHAIBLE K， et al. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration[J]. De?velopmental Biology， 2001， 240（2）：488-498.

[5]HACKER A， CAPEL B， GOODFELLOW P， et al. Expression of Sry， the mouse sex determining gene[J]. Development， 1995， 121（6）：1603-1614.

[6]SALIC A，MITCHISON T J.A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（7）： 2415-2420.

[7]FUJIWARA Y， KOMIYA T， KAWABATA H， et al. Isolation of a DEAD-family protein gene that encodes a murine homolog of Drosophila vasa and its specific expression in germ cell lin eage[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1994， 91（25）：12258-12262.

[8]NOCE T， OKAMOTO-ITO S， TSUNEKAWA N. Vasa homolog genes in mammalian germ cell developmental. Cell Structure and Function， 2001， 26（3）： 131-136.

[9]MYERS M， BRITT K L， WREFORD N G M， al. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary [J]. Reproduction， 2004， 127（5）： 569-580.

[10]PEPLING M E， SPRADLING A C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts[J] ，Development， 1998， 125（17）： 3323-3328.

[11]PEPLING M E，SPRADLING A C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial folli- cles[J]. Developmental Biology， 2001， 234（2）： 339-351.

[12]XU B， HUA J， ZHANG Y， et al. Proliferating cell nuclear antigen （PCNA） regulates primordial follicle assembly by pro?moting apoptosis of oocytes in fetal and neonatal mouse o- varies[J]. PloS One， 2011， 6（1）： l604.