NaCl脅迫對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

薩娜瓦爾?艾比布拉　阿依努爾?阿布拉　陳全家等

摘要[目的] 為鷹嘴豆的抗性研究奠定細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。[方法] 以鷹嘴豆根尖為材料， 用不同濃度的 NaCl 溶液 （0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L）分別處理24和48 h，觀察根尖分生組織細(xì)胞有絲分裂及染色體行為。[結(jié)果] 當(dāng) NaCl濃度≥0.1 mol/L時(shí)，處于分裂期的細(xì)胞逐漸減少， 并且鷹嘴豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)染色體黏連、后期染色體分離不同步、微核、染色體斷裂、染色體橋、不均等分裂、后期滯后染色體等畸變現(xiàn)象。[結(jié)論] NaCl 作為一種脅迫因子， 對(duì)鷹嘴豆細(xì)胞的有絲分裂有抑制作用， 且具有遺傳毒性效應(yīng)。

關(guān)鍵詞NaCl；鷹嘴豆；有絲分裂指數(shù)；染色體畸變率

中圖分類(lèi)號(hào)S503.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-008-03

Effects of Salt Stress on Mitosis of Root Tip Cell in Chickpea

SANAWAER Aibibula， AYINUER Abula， CHEN Quanjia et al

（College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052）

Abstract[Objective] The research aimed to lay the foundation of cell genetics for the study of resistance of chickpea. [Method] Chickpea root tips were treated by NaCl solutions of different concentrations （0.05， 0.10， 0.15， 0.20， 0.25 mol/L） for 24 and 48 h， and the cell mitosis of root meristem and chromosome behavior were observed. [Result] When NaCl concentration≥0.1 mol/L， the mitotic cells decreased gradually， and the chickpea root tip cells appeared chromosome conglutination， out of synchronization of anaphase chromosome separation， micronucleus， chromosome bridge， unequal division in the later stage， and lagging chromosomes aberration phenomenon， etc. [Conclusion] As a stress factor， NaCl had the inhibitory effects on chickpea mitosis and the genetic toxicity effects.

Key words NaCl； Chickpea； Mitotic index； Chromosome aberration

鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）是世界第二大食用豆類(lèi)，是印度、中東、南美洲重要的糧食作物[1]。我國(guó)鷹嘴豆主要分布于新疆、青海、甘肅和云南等省。新疆鷹嘴豆資源較豐富，是我國(guó)鷹嘴豆外貿(mào)出口的重要產(chǎn)地[2]。與其他豆類(lèi)作物相比，鷹嘴豆具有需水少、 成本低、 經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[3]。

根尖分生區(qū)的有絲分裂活動(dòng)是植物體得以正常生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，而頂端分生組織區(qū)是植物體對(duì)不良環(huán)境因子反應(yīng)最敏感的區(qū)域[4]。國(guó)內(nèi)已有不少關(guān)于土壤鹽漬化影響體細(xì)胞分裂的報(bào)道，研究對(duì)象涉及大蒜、玉米、小麥、水稻、黑麥、豌豆等[5-10]。目前，鷹嘴豆的研究主要是集中在鷹嘴豆的營(yíng)養(yǎng)成分、藥理作用、生態(tài)價(jià)值以及耐鹽生理等方面，而關(guān)于鷹嘴豆細(xì)胞遺傳學(xué)的研究至今鮮有報(bào)道[11-13]。以鷹嘴豆根尖為材料，筆者測(cè)定其在NaCl脅迫下的有絲分裂指數(shù)和染色體畸變率，為鷹嘴豆的抗性研究奠定細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鷹嘴豆品種213號(hào)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

鷹嘴豆根尖的培養(yǎng)。首先，將選好的鷹嘴豆種子在清水中泡24 h，然后在25 ℃下置于盛有水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)發(fā)根，每日換水2次，待不定根長(zhǎng)至0.5 cm 時(shí)將鷹嘴豆根尖移置盛有5種濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L）的NaCl溶液中，并且設(shè)蒸餾水為陰性對(duì)照組，分別培養(yǎng)24、48 h，在上午8：00～10：00剪取根尖。

1.2.2

染色體制片的準(zhǔn)備。根尖在4 ℃用卡諾式固定液固定18～24 h，然后移入濃度70%乙醇保存液中，在4 ℃冰箱內(nèi)保存。制片時(shí)，先用蒸餾水沖洗根尖，然后將根尖放入盛有1 mol/L HCl 的小燒杯中，在60 ℃水浴條件下解離鷹嘴豆根尖7～9 min，用改良的笨酚品紅染色液染色10～15 min，常規(guī)壓片。

1.2.3

鏡檢計(jì)數(shù)。對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組觀察10個(gè)根尖，每個(gè)根尖統(tǒng)計(jì)約2 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率。

有絲分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/觀察總細(xì)胞數(shù)×100%

染色體畸變率=染色體畸變細(xì)胞數(shù)/觀察總細(xì)胞數(shù)×1 000‰

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1鷹嘴豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)

有絲分裂指數(shù)是體細(xì)胞分裂的頻率和根尖生長(zhǎng)速率的一個(gè)重要參數(shù)[14]。通過(guò)觀察鷹嘴豆根尖分生區(qū)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度和處理時(shí)間均影響鷹嘴豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)。由表1可知，當(dāng)NaCl濃度為0.05 mol/L時(shí)，處理24、48 h的有絲分裂指數(shù)分別為5.56%、5.84%，均高于對(duì)照，且差異不顯著。這說(shuō)明低濃度的NaCl對(duì)根尖細(xì)胞分裂有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)NaCl濃度0.1 mol/L時(shí)，處理48 h的有絲分裂指數(shù)為4.32%，低于對(duì)照，出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。當(dāng)NaCl濃度為0.15 mol/L時(shí)，差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明高濃度的NaCl可通過(guò)干擾細(xì)胞分裂周期，使得細(xì)胞分裂周期延長(zhǎng)，從而降低細(xì)胞分裂指數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果還表明，當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，隨著NaCl作用時(shí)間的延長(zhǎng)，鷹嘴豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)逐漸降低，說(shuō)明相同濃度的NaCl對(duì)有絲分裂的抑制作用表現(xiàn)出鹽脅迫的累積效應(yīng)。

表1不同濃度NaCl 溶液對(duì)鷹嘴豆根尖生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

處理時(shí)間∥hNaCl濃度∥mol/L有絲分裂指數(shù)∥%

2405.32

0.055.56

0.104.90

0.154.74*

0.203.23**

0.252.38**

4805.54

0.055.84

0.104.32*

0.15 3.65**

0.20 2.86**

0.25 2.16**

注： * P<0.05，** P<0.01。

2.2鷹嘴豆根尖細(xì)胞染色體畸變率

NaCl誘導(dǎo)鷹嘴豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)染色體畸變現(xiàn)象?；冾?lèi)型主要有染色體黏連、后期染色體分離不同步、微核、染色體橋、染色體斷裂、不均等分裂、后期滯后染色體等（圖1）。

由表2可知，當(dāng)NaCl濃度為0.05 mol/L，處理24 h時(shí)，沒(méi)有觀察到染色體畸變類(lèi)型；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.15 mol/L時(shí)，總畸變率為1.34‰，與對(duì)照相比有極顯著差異（P<0.01）。在處理48 h時(shí)，NaCl 濃度0.10 mol/L時(shí)總畸變率與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05），NaCl濃度為0.15 mol/L時(shí)總畸變率達(dá)到2.30‰，且差異極顯著（P<0.01）。由此可知，當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，NaCl對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞的畸變作用隨著NaCl濃度的增加而加強(qiáng)；隨著NaCl作用時(shí)間的延長(zhǎng)，鷹嘴豆根尖細(xì)胞染色體畸變率升高。

注：A.染色體黏連；B.后期染色體分離不同步；C.微核；D.不均等分裂；E：染色體橋；F.滯后染色體；G.染色體斷裂。

圖1染色體異常行為圖片

表2不同濃度NaCl 溶液對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞染色體行為的影響

處理時(shí)間∥hNaCl濃度mol/L異常分裂細(xì)胞比率∥‰

黏聯(lián)染色體不同步分離微核不均等分裂染色體橋染色體斷裂落后染色體染色體總畸變率∥‰

24000000000

0.0500000000

0.100.1700.25000.1300.55

0.150.2900.510.1200.270.151.34**

0.200.530.280.760.210.120.450.292.64**

0.250.790.261.060.350.160.580.373.57**

48000000000

0.05000.2100000.21

0.100.2700.330.1000.1100.81*

0.150.480.150.610.220.190.370.282.30**

0.200.780.310.940.370.310.640.493.84**

0.251.060.271.290.480.530.840.615.08**

注： * P<0.05，** P<0.01。

顯微鏡觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)還表明，在鷹嘴豆根尖細(xì)胞表現(xiàn)的各種畸變類(lèi)型中，微核、染色體黏聯(lián)和染色體斷裂所占的比例較高。微核的形成主要是由染色體畸變引起的，即不正常的有絲分裂過(guò)程中形成的染色體斷片和滯后染色體，在細(xì)胞分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成主核之外的核塊，當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核以外的小核，即形成微核，引起基因片段的丟失和基因的重組[15]。染色體黏聯(lián)的出現(xiàn)是因?yàn)?NaCl 對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞染色體產(chǎn)生毒害，增加染色體的黏性，染色體之間不易分開(kāi)，表現(xiàn)為染色體形態(tài)不清晰，中期染色體集中在一起不能計(jì)數(shù)。NaCl 濃度較高或作用時(shí)間較長(zhǎng)，可造成染色體斷裂，兩條斷裂端相互愈合，產(chǎn)生雙著絲粒染色體，在細(xì)胞分裂后期受2個(gè)著絲粒的牽引會(huì)出現(xiàn)染色體橋。如果染色體斷裂后的游離端相互黏聯(lián)，那么會(huì)導(dǎo)致不均等分裂[16]。所以，染色體斷裂是染色體各種結(jié)構(gòu)變異的前奏。

3結(jié)論與討論

植物的抗鹽性是一個(gè)極為復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程。不同植物甚至同一種類(lèi)不同品種的植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)及其適應(yīng)機(jī)制也不盡相同[17]。該次研究選用較高濃度的NaCl溶液（0.05～0.25 mol/L）培養(yǎng)鷹嘴豆。結(jié)果表明，NaCl溶液對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生抑制作用，且隨著NaCl濃度的增加以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，有絲分裂指數(shù)明顯下降，說(shuō)明有絲分裂指數(shù)與處理液濃度、處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

在正常情況下，細(xì)胞周期受到一系列基因、酶和蛋白質(zhì)等內(nèi)在因素的精確調(diào)控。外界環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞分裂的影響是通過(guò)內(nèi)因起作用的。因此，NaCl有可能造成DNA分子的損傷，從而影響酶或蛋白質(zhì)的作用，擾亂正常的代謝關(guān)系，改變細(xì)胞內(nèi)原有的物質(zhì)平衡，阻止細(xì)胞向分裂態(tài)轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地延長(zhǎng)細(xì)胞周期。該試驗(yàn)的顯微觀察和數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步顯示，NaCl溶液能誘發(fā)鷹嘴豆根尖各時(shí)期細(xì)胞產(chǎn)生畸變?nèi)旧w。所觀察到的染色體畸變類(lèi)型主要有染色體黏連、后期染色體分離不同步、微核、染色體橋、不均等分裂、滯后染色體、染色體斷裂等。染色體是基因的載體。染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異可能改變基因的劑量或基因之間的關(guān)系，從而改變遺傳信息，引起生物性狀發(fā)生變異[18]。因此，研究NaCl脅迫對(duì)鷹嘴豆根尖細(xì)胞染色體行為的影響，從遺傳學(xué)角度揭示鹽害機(jī)理，豐富鷹嘴豆遺傳育種基礎(chǔ)，具有重大意義。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

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