脂肪酶催化紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的研究

劉瑞麗，劉 偉，畢艷蘭

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

環(huán)氧化反應(yīng)是指在化合物雙鍵兩端碳原子間加上一原子氧形成三元環(huán)的氧化反應(yīng).環(huán)氧植物油是由天然植物油與過氧化物環(huán)氧化得到的一類含有環(huán)氧基團(tuán)的改性油脂.環(huán)氧植物油是一種可降解、可再生的環(huán)保型增塑劑，與傳統(tǒng)的鄰苯類增塑劑相比，有耐熱、耐光、無毒和穩(wěn)定性好等特點(diǎn).在許多國家，環(huán)氧植物油可直接用于食品、藥品的包裝材料，也可用于玩具及家庭裝飾材料的助劑.此外，環(huán)氧植物油還可以用作潤滑劑、穩(wěn)定劑、涂料添加劑、生物聚合物、合成樹脂等，具有廣闊的市場前景[1-7].可用于環(huán)氧化反應(yīng)的植物油富含不飽和脂肪酸，如大豆油、玉米油、葵花籽油、菜籽油、芝麻油、棉籽油、桐油、花生油、紅花油和亞麻籽油等[8-10].紅花籽油又稱紅花油，是以紅花籽為原料制取得到的，它外觀呈淡黃色至黃色，有輕微的果仁味.紅花油中約有90%不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量在73%～85%[11-12]，其碘值較高，是制備環(huán)氧油脂的理想原料之一.目前采用化學(xué)法制備各種環(huán)氧化油脂的研究較多，但化學(xué)法多采用強(qiáng)酸作催化劑，對設(shè)備的腐蝕性較大[13-14].

本課題以紅花油為原料，甲苯為反應(yīng)溶劑，脂肪酶Novozym435 為催化劑，脂肪酸為攜氧劑，雙氧水為環(huán)氧化試劑進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)，制備環(huán)氧紅花油.考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、雙氧水用量、酶用量、脂肪酸用量對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鄉(xiāng)味珍低溫壓榨紅花籽油：壓榨三級，酒泉市肅州區(qū)新地新一酒坊，碘值147.65 g/100 g，酸值0.05 mg/g，過氧化值12.87 mmol/kg；Novozym435：7 000 PLU/g，丹麥諾維信公司；硬脂酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫：分析純，洛陽化學(xué)試劑廠；0.15 mol/L NaOH 溶液、1%酚酞指示劑、甲酚紅-百里香酚藍(lán)混合指示液：自制.

1.2 儀器與設(shè)備

GC-6890N 型氣相色譜儀：美國Agilent 公司；DF101-Z 控溫磁力攪拌器、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；2XZ-2 型旋片式真空泵：北京中興偉業(yè)儀器有限責(zé)任公司；BS210s 電子天平：賽多利斯天平有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

在250 mL 三口圓底燒瓶中加入紅花油5 g，一定量的硬脂酸和脂肪酶Novoyzm435，甲苯30 mL作為溶劑，置于水浴鍋中反應(yīng).在攪拌情況下，將一定量的30%過氧化氫在10 min 內(nèi)逐滴加至反應(yīng)混合物中，保持恒溫，反應(yīng)一定時(shí)間.

1.4 產(chǎn)品純化

環(huán)氧化反應(yīng)完成后，加入過量的氫氧化鈉溶液中和硬脂酸，將所得混合物通過真空抽濾進(jìn)行分離.酶顆粒及脂肪酸的鈉鹽會留在濾紙上方，環(huán)氧油及溶劑等作為濾液收集在抽濾瓶中.將濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用熱水水洗至中性（pH 試紙檢測）.水洗后，產(chǎn)品中的微量水分用無水硫酸鈉除去；殘留的溶劑，在減壓條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去，即得到最終產(chǎn)品環(huán)氧紅花油.

1.5 分析方法

1.5.1 環(huán)氧值的測定

環(huán)氧值的測定采用GB/T 1677—2008 方法.酸價(jià)的測定采用GB/T 5530—2008 方法.碘值的測定采用GB/T 5532—2008 方法.過氧化值的測定采用GB/T 5538—2008 方法.環(huán)氧紅花油理論環(huán)氧值與環(huán)氧值轉(zhuǎn)化率按下式計(jì)算：

式中：OOex為試驗(yàn)環(huán)氧值；OOth為理論環(huán)氧值；RCO為環(huán)氧值轉(zhuǎn)化率；IV 為碘值；Ai為碘的相對分子質(zhì)量126.90；Ao為氧的相對分子質(zhì)量16.0.

經(jīng)測定，IV=144.87 g/100 g.計(jì)算得出理論環(huán)氧值OOth=8.36%；本試驗(yàn)的測定環(huán)氧值OOex=7.25%；環(huán)氧值轉(zhuǎn)化率RCO=（7.25/8.36）×100%=86.66%.

1.5.2 紅花油組分分析

油樣甲酯化方法采用GB/T 17376—2008 方法，氣相色譜分析采用GB/T 17377—2008 方法.氣相色譜的條件如下.儀器：Agilent 6890N；檢測器：氫火焰離子化檢測器；BPX-70 毛細(xì)管脂肪酸分析柱：30.0 m×320 μm×0.50 μm；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；柱溫：210 ℃；檢測器溫度：300 ℃；氮?dú)饬魉伲?.0 mL/min；氫氣流速：35 mL/min；空氣流速：400 mL/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 紅花油脂肪酸組成分析

紅花油的脂肪酸組成分析結(jié)果見表1.

表1 紅花油中主要脂肪酸組成（面積歸一化法）Table 1 Fatty acid composition of safflower oil(Area normalization method)

由表1 可知，紅花油中飽和脂肪酸含量約為9.65%，不飽和脂肪酸含量約為89.81%.環(huán)氧化反應(yīng)是在脂肪酸雙鍵兩端碳原子間加上一原子氧形成三元環(huán)的氧化反應(yīng).因此，紅花油是制備環(huán)氧化油脂的理想原料.

2.2 反應(yīng)溫度對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響

本試驗(yàn)所選用的催化劑為脂肪酶Novozym435，其活性受溫度的影響較大.反應(yīng)溫度不僅影響反應(yīng)物分子中活化分子的比例，還影響催化劑的活性.因此，對反應(yīng)溫度的研究至關(guān)重要.本試驗(yàn)環(huán)氧化反應(yīng)條件為紅花油5 g、酶0.15 g（油質(zhì)量的3%）、雙氧水10 mL、硬脂酸0.000 5 mol、反應(yīng)時(shí)間4 h，考察了不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）對環(huán)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 反應(yīng)溫度對環(huán)氧值的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on oxirane oxygen

由圖1 可知，當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，紅花油的環(huán)氧值隨之增加.反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，其環(huán)氧值達(dá)到最大，為2.10%，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率為25.12%.與最初的30 ℃相比，環(huán)氧值升高了0.36 個(gè)百分點(diǎn)，轉(zhuǎn)化率升高了4.3 個(gè)百分點(diǎn).之后隨著反應(yīng)溫度的升高環(huán)氧值反而降低，并且在反應(yīng)溫度高于50 ℃后產(chǎn)物環(huán)氧值驟降.這是由于本試驗(yàn)所選用的催化劑為脂肪酶Novozym435，其最適反應(yīng)溫度為45 ℃左右.當(dāng)反應(yīng)溫度低于40℃時(shí)，酶的活性受抑制，其對反應(yīng)的催化作用發(fā)揮得不夠充分；而溫度過高又使酶部分失活，失活后的酶對反應(yīng)沒有催化作用，故而所得產(chǎn)品的環(huán)氧值較低.另外，在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)溫度，反應(yīng)物分子動(dòng)能增加，進(jìn)而分子間的有效碰撞幾率也隨之升高，反應(yīng)加速.但產(chǎn)物中的環(huán)氧基團(tuán)、雙氧水及中間產(chǎn)物過氧酸都不耐高溫，反應(yīng)溫度過高，會加劇環(huán)氧基團(tuán)的開環(huán)反應(yīng)及雙氧水和過氧酸的分解，使反應(yīng)平衡逆向移動(dòng)，產(chǎn)品環(huán)氧值下降.此外，反應(yīng)溫度過高，不僅浪費(fèi)能源，還導(dǎo)致碳碳雙鍵發(fā)生聚合反應(yīng)生成著色物，產(chǎn)品顏色加深，質(zhì)量變差.綜合考慮，環(huán)氧化反應(yīng)以40 ℃為宜.

2.3 硬脂酸用量對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響

硬脂酸在環(huán)氧化反應(yīng)中作為攜氧劑即氧的載體，它的存在是環(huán)氧化反應(yīng)能順利進(jìn)行的前提.環(huán)氧化反應(yīng)中，脂肪酸在酶的催化作用下被H2O2氧化生成過氧脂肪酸，過氧脂肪酸再使油脂的不飽和雙鍵環(huán)氧化.其過程如圖2 所示.

圖2 環(huán)氧化反應(yīng)的過程Fig.2 The mechanism of epoxidation reaction

因此，硬脂酸用量是環(huán)氧化反應(yīng)的影響因素之一.本試驗(yàn)環(huán)氧化反應(yīng)條件為紅花油5 g、酶0.15 g（油質(zhì)量的3%）、反應(yīng)溫度40 ℃、雙氧水10 mL、反應(yīng)時(shí)間4 h，考察了硬脂酸的用量（0.000 5 mol、0.001 mol、0.002 mol、0.003 mol、0.004 mol、0.005 mol、0.006 mol、0.007 mol、0.008 mol）對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3 所示.

圖3 硬脂酸用量對環(huán)氧值的影響Fig.3 Effect of stearic acid amount on oxirane oxygen

由圖3 可知，當(dāng)硬脂酸用量小于0.006 mol時(shí)，隨著硬脂酸用量不斷的增加，所生成的環(huán)氧紅花油的環(huán)氧值也在逐漸上升.當(dāng)硬脂酸用量增加到0.006 mol 時(shí)，紅花油的環(huán)氧值達(dá)到5.57%，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率為66.63%.之后，隨著硬脂酸用量的增加，環(huán)氧值反而有所降低.這是由于硬脂酸在反應(yīng)體系中可以轉(zhuǎn)移活性氧，如果其濃度過低，則反應(yīng)生成的過氧硬脂酸濃度低，不利于環(huán)氧化反應(yīng)的正向移動(dòng)；若硬脂酸用量過多，則體系的酸度增加，催化劑中毒，過多的硬脂酸還會使環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，進(jìn)而使產(chǎn)品環(huán)氧值下降.綜合考慮，硬脂酸用量以0.006 mol 為宜.

2.4 反應(yīng)時(shí)間對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時(shí)間對紅花油的環(huán)氧化有顯著影響.本試驗(yàn)環(huán)氧化反應(yīng)條件為紅花油5 g、酶0.15 g（油質(zhì)量的3%）、雙氧水10 mL、硬脂酸0.006 mol、反應(yīng)溫度40 ℃，考察了不同反應(yīng)時(shí)間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 反應(yīng)時(shí)間對環(huán)氧值的影響Fig.4 Effect of reacton time on oxirane oxygen

由圖4 可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物的環(huán)氧值也在逐漸增加，到10 h 達(dá)到最大值.在2～10 h 內(nèi)環(huán)氧化反應(yīng)向著生成環(huán)氧基團(tuán)的方向移動(dòng)，環(huán)氧化物逐漸增多，反應(yīng)10 h 時(shí)，體系中環(huán)氧基團(tuán)累計(jì)最多，產(chǎn)物環(huán)氧值達(dá)到最大，為6.85%，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.94%.10 h 后，由于酸的存在，催化劑中毒，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長生成的水逐漸增多，使反應(yīng)生成的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，因此，產(chǎn)品環(huán)氧值會有所下降.其原理如圖5 所示.

圖5 酶催化環(huán)氧化反應(yīng)與環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)副反應(yīng)Fig.5 Enzymatic epoxidation and the side reactions

為了節(jié)約成本及減少能源消耗，在保證環(huán)氧值達(dá)到要求的前提下，應(yīng)盡可能縮短反應(yīng)時(shí)間.綜合考慮，環(huán)氧化反應(yīng)時(shí)間以10 h 為宜.

2.5 加酶量對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響

酶作為反應(yīng)的催化劑，能降低反應(yīng)的活化能，增大活化分子的百分比，直接影響環(huán)氧化反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間.本試驗(yàn)環(huán)氧化反應(yīng)條件為紅花油5 g、反應(yīng)溫度40 ℃、雙氧水10 mL、硬脂酸0.006 mol、反應(yīng)時(shí)間10 h，考察了酶的用量（1%、2%、3%、4%、5%）對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6 所示.

圖6 加酶量對環(huán)氧值的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on oxirane oxygen

由圖6 可知，在其他反應(yīng)條件相同時(shí)，酶的用量影響產(chǎn)品的環(huán)氧值.在加酶量小于4%時(shí)，隨著酶添加量的增加，環(huán)氧值也在不斷增加.酶用量為1%時(shí)，產(chǎn)品的環(huán)氧值為6.09%，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率為72.79%；酶的用量為4%的時(shí)候，產(chǎn)物的環(huán)氧值達(dá)到最大，為7.25%，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率為86.66%，之后隨著加酶量的增加環(huán)氧值有輕微的下降.可見，當(dāng)酶的用量達(dá)到飽和后，再增加酶的用量反而會使反應(yīng)物的濃度相對降低，不利于反應(yīng)的正向移動(dòng)，于反應(yīng)結(jié)果無益.綜合考慮，酶的最適添加量為油質(zhì)量的4%，即0.20 g.

2.6 雙氧水用量對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響

雙氧水作為環(huán)氧化反應(yīng)的攜氧劑，其用量是影響紅花油環(huán)氧化的重要因素之一.本試驗(yàn)環(huán)氧化反應(yīng)條件為紅花油5 g、酶0.20 g（油質(zhì)量的4%）、反應(yīng)溫度40 ℃、硬脂酸0.006 mol、反應(yīng)時(shí)間10 h，考察了雙氧水的用量（5 mL、7.5 mL、10 mL、12.5 mL、15 mL）對紅花油環(huán)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖7 所示.

圖7 雙氧水用量對環(huán)氧值的影響Fig.7 Effect of the H2O2 amount on oxirane oxygen

由圖7 可知，當(dāng)雙氧水用量小于10 mL 時(shí)，增加雙氧水的用量，產(chǎn)品的環(huán)氧值也隨之增加.雙氧水的用量增加到10 mL 時(shí)，產(chǎn)品的環(huán)氧值達(dá)到7.25%，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為86.66%，與最初的5 mL 添加量相比，產(chǎn)品環(huán)氧值升高了0.61 個(gè)百分點(diǎn)，轉(zhuǎn)化率升高了7.23 個(gè)百分點(diǎn).然而，隨著雙氧水用量的進(jìn)一步增加，產(chǎn)品的環(huán)氧值反而會下降.這主要是由于當(dāng)雙氧水用量較少時(shí)，環(huán)氧化反應(yīng)的直接參與者（過氧酸）生成量較少，環(huán)氧化反應(yīng)不能正常的進(jìn)行，因此環(huán)氧化反應(yīng)正向移動(dòng)，產(chǎn)品環(huán)氧值也隨之增加.本試驗(yàn)添加的是30%雙氧水，當(dāng)其用量過多會增大體系中水分的含量，導(dǎo)致環(huán)氧基團(tuán)的開環(huán)副反應(yīng)加劇，使環(huán)氧值降低.綜合考慮，環(huán)氧化反應(yīng)中雙氧水的添加量以10 mL 為宜.

2.7 正交試驗(yàn)

為了優(yōu)化紅花油環(huán)氧化的最佳條件，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，在脂肪酶添加量為4%的基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度、硬脂酸用量、雙氧水用量及反應(yīng)時(shí)間4 個(gè)因素作為考察對象，各取3 個(gè)水平，利用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn).因素與水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2.

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal experimental design,results,and range analysis

從表2 可以看出，極值R 能夠反映出4 個(gè)因素對環(huán)氧值的影響大小為：D＞A≈B＞C，即因素的影響順序?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度≈硬脂酸用量＞雙氧水用量.因此得到最佳正交組合A2B2C3D2，即反應(yīng)時(shí)間10 h，反應(yīng)溫度40 ℃，硬脂酸用量0.006 mol，雙氧水用量10 mL.

驗(yàn)證試驗(yàn)：以上述條件為準(zhǔn)，其他條件不變的情況下，做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到環(huán)氧值為7.25%，轉(zhuǎn)化率為86.66%.

3 結(jié)論

研究了影響紅花油環(huán)氧化的單因素（反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、雙氧水用量、酶的用量、硬脂酸的用量）并進(jìn)行了多因素正交試驗(yàn)，得到了紅花油環(huán)氧化的最佳反應(yīng)條件為紅花油5 g、甲苯30 mL、雙氧水用量10 mL、脂肪酸用量0.006 mol、酶用量4%、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間10 h.在此工藝條件下制得的環(huán)氧紅花油的環(huán)氧值為7.25%，環(huán)氧值轉(zhuǎn)化率為86.66%.

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