他莫昔芬對牙髓干細(xì)胞體外分化的影響

王 娟，劉寶剛，馬逢樂，何欣遙，王志華，何文喜

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫(yī)院禮士路門診部，北京100820）

他莫昔芬對牙髓干細(xì)胞體外分化的影響

王 娟1，劉寶剛2，馬逢樂1，何欣遙1，王志華1，何文喜1

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫(yī)院禮士路門診部，北京100820）

目的：體外觀察他莫昔芬（Tamoxifen）對牙髓干細(xì)胞分化的作用。方法：培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs），將hDPSCs用不同濃度的他莫昔芬刺激不同時(shí)間，CCK－8法檢測細(xì)胞的增殖情況；礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，RT－PCR檢測各組礦化相關(guān)基因堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨唾液酸蛋白（BSP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）的表達(dá)水平。結(jié)果：10μmol／L他莫昔芬抑制hDPSCs增殖，其他濃度對hDPSCs無明顯影響；與對照組相比0．5、1、2．5、5、10μmol／L他莫昔芬均能促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，其中5μmol／L最明顯；且與對照組相比，5μmol／L他莫昔芬明顯上調(diào)礦化相關(guān)基因ALP、OCN、BSP和DSPP的mRNA表達(dá)水平。結(jié)論：他莫昔芬可明顯促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成骨／成牙分化。

他莫昔芬；人牙髓干細(xì)胞；成牙分化；成骨分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：294］

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是Gronthos等［1］（2000）利用酶消化法從牙髓組織中分離純化出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖力、自我更新和多向分化能力，在一定誘導(dǎo)條件下可向特定的細(xì)胞類型分化，在牙髓修復(fù)和牙齒再生中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞在體外礦化液誘導(dǎo)下可形成成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，形成礦化結(jié)節(jié)［1］，但其分化的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制目前尚不清楚。

他莫昔芬（Tamoxifen）是一種雌激素受體抑制劑，在臨床有著廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)他莫昔芬是治療雌激素受體陽性乳腺癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”藥物［2］，臨床長期使用他莫昔芬會(huì)引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［3－4］。體外研究證實(shí)，他莫昔芬能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的脂肪變性［5］。雌激素在調(diào)控干細(xì)胞分化方面有重要作用，黃素類物質(zhì)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［6］，而他莫昔芬作為一種雌激素受體抑制劑，有關(guān)其對人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的作用尚不清楚，他莫昔芬是否可以促進(jìn)hDPSCs的分化，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

α－MEM培養(yǎng)基、I型膠原酶、Dispase酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；胎牛血清（HyClone，美國）；他莫昔芬（Invivo Gene，美國）、β－甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、茜素紅（Sigma，美國）；細(xì)胞活力檢測試劑盒（上海恩晶生物）；細(xì)胞總RNA提取試劑盒（Omega，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real－Time PCR試劑盒（Takara，日本）；二氧化碳恒溫孵箱（Thermo，美國）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；Real－time PCR儀、ABI Prism 7500 Real－Time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）。

1．2 hDPSCs的體外分離和培養(yǎng)

臨床收集18～25歲志愿者正畸減數(shù)新鮮拔除的健康完整恒牙，750 mL／L乙醇擦拭牙體，含雙抗的PBS浸洗2次；無菌條件下取出牙髓，置PBS浸洗2次，將牙髓剪成1～2 mm大小的組織塊后，1 000 r／min離心5 min，棄上清；加入4 mg／L I型膠原酶37℃消化40 min；每10 min震蕩1次，共3次，1 000 r／min離心5min，棄上清；用含200 mL／L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液清洗3遍；1 000 r／min離心5 min，收集細(xì)胞并用含200mL／L胎牛血清的α－MEM重懸后，接種于35 mm培養(yǎng)皿，置37℃，50 mL／L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞融合至80%時(shí)，50 g／L胰酶消化，用有限稀釋法挑取單細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，備用。

1．3 他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響

將第3代hDPSCs用無血清10 mL／Lα－MEM培養(yǎng)液以3×103／孔接種于96孔板，共30孔，為防止邊緣效應(yīng)，周邊36孔加200μL PBS。置于37℃，50 mL／L CO2孵箱24 h后，分為對照組（空白組）和分別含有0．5、1、2．5、5、10μmol／L他莫昔芬實(shí)驗(yàn)組；分別在1、3、5、7 d時(shí)每孔加入10μL CCK－8工作液，置于37℃，50 mL／L CO2孵箱4 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4 他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化的影響

1．4．1 實(shí)驗(yàn)分組及礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)

將P3代hDPSCs接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)組分別加入含0．5、1、2．5、5μmol／L他莫昔芬的10 mL／L礦化誘導(dǎo)液（含10 mmol／Lβ－甘油磷酸鈉，50μg／mL維生素C，1×10－8mol／L地塞米松、100 mL／L FBS的α－MEM培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)2周；空白組為10 mL／Lα－MEM培養(yǎng)液，對照組加入10 mL／L礦化液均繼續(xù)培養(yǎng)2周。

1．4．2 RT－PCR檢測礦化相關(guān)基因OCN、ALP、BSP、DSPPmRNA

礦化誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞棄上清，PBS沖洗兩遍；將6孔板置于冰上，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（所有操作步驟均嚴(yán)格按產(chǎn)品說明）；利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具設(shè)計(jì)相關(guān)引物，并以cDNA為模板、GAPDH作為內(nèi)參，按照TAKARA實(shí)時(shí)PCR試劑盒步驟用ABIPrism 7500 Real－Time PCR系統(tǒng)檢測各礦化相關(guān)基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteonectin，OCN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）mRNA的表達(dá)水平。所用引物由上海生工生物股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR所用引物名稱及序列

1．4．3 茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成

不同刺激組細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)2周后，PBS漂洗3遍，40 g／L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3遍后加入100 g／L（pH＝4．2）的茜素紅液，室溫閉光固定15 min后蒸餾水漂洗至染液無色，倒置顯微鏡觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況，最后用PBS配置的100 g／L氯化十六烷基吡啶進(jìn)行茜素紅定量分析，6孔板每孔加1 mL 100 g／L氯化十六烷基吡啶，置于搖床上混勻20 min后，將各組樣本取100μL，5個(gè)復(fù)孔加入96孔板，測定490 nm處的吸光度值，取各組平均值作統(tǒng)計(jì)分析。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響

10μmol／L他莫昔芬組與對照組相比在第5天后表現(xiàn)出明顯的抑制hDPSCs增殖的作用，而0．5、1、2．5、5μmol／L刺激組對hDPSCs增殖無明顯影響（圖1）。

圖1 不同濃度他莫昔芬刺激hDPSCs后對其增殖能力的影響

2．2 他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化的影響

2．2．1 礦化誘導(dǎo)2周后茜素紅染色觀察各組礦化結(jié)節(jié)的形成

礦化2周后茜素紅染色結(jié)果表明（圖2），與對照組相比各組均能促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，其中5μmol／L刺激組礦化效果比其他刺激組更加明顯，鏡下及茜素紅定量結(jié)果（圖3～4）與肉眼觀察一致。

2．2．2 RT－PCR檢測他莫昔芬刺激礦化誘導(dǎo)2周后礦化相關(guān)基因變化

礦化2周后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中礦化相關(guān)基因OCN、ALP、BSP、DSPP的mRNA表達(dá)水平，以5μmol／L組最顯著（圖5）。

圖2 礦化誘導(dǎo)2周后茜素紅染色情況

圖3 顯微鏡下礦化誘導(dǎo)2周后觀察（×40）

圖4 礦化誘導(dǎo)2周后茜素紅定量結(jié)果

圖5 礦化誘導(dǎo)2周后各組ALP、OCN、DSPP、BSPmRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

干細(xì)胞是人體內(nèi)較原始，未分化的細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化能力，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。Gronthos等［1］第一次成功分離鑒定hDPSCs并闡明其生物學(xué)特性后，使得牙髓干細(xì)胞成為當(dāng)下研究的新焦點(diǎn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨組織和免疫系統(tǒng)中都存在雌激素受體［7］，雌激素在調(diào)節(jié)炎癥以及腫瘤細(xì)胞方面有重要的作用［8－9］。研究發(fā)現(xiàn)在牙周膜細(xì)胞中存在雌激素受體，女性更易于發(fā)生牙周炎可能與牙周膜細(xì)胞存在雌激素受體有關(guān)［10－11］。通過檢測人牙髓細(xì)胞雌激素基因表達(dá)水平以及成骨誘導(dǎo)分化，表明牙髓細(xì)胞表面存在雌激素受體，且雌激素能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞的骨向分化［12－14］；在牙髓干細(xì)胞方面，也有研究證實(shí)雌二醇能夠通過NF－κB通路促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨／成牙分化的能力［15］，表明牙髓干細(xì)胞表面存在雌激素受體。

他莫昔芬作為臨床治療乳腺癌常用藥物，能夠作為雌激素受體抑制劑發(fā)揮作用，但常有骨質(zhì)疏松及肝脂肪變性現(xiàn)象發(fā)生［4－5］。本實(shí)驗(yàn)通過CCK－8實(shí)驗(yàn)觀察他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，0．5、1、2．5、5μmol／L他莫昔芬對細(xì)胞存活率無明顯影響，而當(dāng)濃度提高到10μmol／L時(shí)，hDPSCs增殖明顯抑制。為了排除他莫昔芬的藥物毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡所造成對細(xì)胞增殖的抑制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5μmol／L為藥物干預(yù)濃度。研究顯示，他莫昔芬抑制人垂體腺瘤細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性［16］，20μmol／L可抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，低于20μmol／L則無抑制作用［17］。他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響不同于上述兩者可能是因?yàn)榧?xì)胞來源及刺激濃度不同導(dǎo)致。

礦化能力是干細(xì)胞成骨的重要特性之一，組織內(nèi)的鈣質(zhì)大部分以磷酸鈣或碳酸鈣的形式存在。茜素紅AR－S法通過鈣離子與茜素紅特異性結(jié)合，可使礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)鮮紅色，因此茜素紅染色是鑒定成骨分化或成牙分化的常用方法之一。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度他莫昔芬礦化誘導(dǎo)2周后，hDPSCs茜素紅染色結(jié)果顯示，與不加他莫昔芬礦化組相比，0．5、1、2．5、5μmol／L各組均能促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成，其中以5μmol／L組最顯著。表明他莫昔芬可促進(jìn)hDPSCs成骨／成牙向分化。

成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞可分泌眾多礦化基質(zhì)蛋白如ALP、OCN、BSP和DSPP等，這些基質(zhì)蛋白在成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中均發(fā)揮重要的作用。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不加刺激對照組比較，加入他莫昔芬刺激后礦化相關(guān)基因ALP、OCN、BSP、DSPPmRNA表達(dá)上調(diào)，但只有5μmol／L他莫昔芬組作用最顯著。表明他莫昔芬能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的成骨／成牙分化，但具有濃度特異性。本結(jié)果與雌激素促進(jìn)牙髓細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞的骨向分化作用相矛盾，分析原因可能有：①與細(xì)胞來源不同有關(guān)；②他莫昔芬除抑制雌激素受體外，還可作為細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑，在礦化過程中，他莫昔芬誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞自噬是否發(fā)揮作用，發(fā)揮多大作用，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本結(jié)果表明低濃度他莫昔芬對牙髓干細(xì)胞增殖無明顯影響，一定濃度的他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步深入研究他莫昔芬對hDPSCs作用的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制，將有利于探討臨床應(yīng)用此藥物時(shí)對牙髓的影響，另外可探索其在牙髓損傷修復(fù)或再生中的應(yīng)用。

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The effect of tamoxifen on the osteoblastic／odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

WANG Juan*，LIU Bao－gang，MA Feng－le，HE Xin－yao，WANG Zhi－h(huán)ua，HEWen－xi
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the effects of tamoxifen on the osteoblastic／odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSCs）in vitro．METHODS：hDPSCs were treated by different concentrations of tamoxifen．Kit－8 assay was applied to assess cell proliferation．Aftermineralization induction culture for 2 weeks，alizarin red S staining was used to observe themineral nodules，themRNA expression of the alkaline phosphatase（ALP），osteonectin（OCN），bone sialoprotein（BSP）and dentin sialophosphoprotein（DSPP）was detected by RT－PCR．RESULITS：Tamoxifen at 10μmol／L inhibited hDPSCs proliferation and lower concentration showed no effect．All concentration of tamoxifen increasedmineral nodule formation of hDPSCs，5μmol／L tamoxifen showed themost significant effect（P＜0．05）．Furthermore，themRNA expression of ALP，OCN，BSP and DSPPwasmarkedly upregulated by 5μmol／L tamoxifen treatment．CONCLUSION：Tamoxifen promotes mineralization and mineralization－related genes expression and might play a vital role on the differentiation of hDPSCs．

tamoxifen；human dental pulp stem cells；osteoblastic differentiation；odontoblastic differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0294－05

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．007

2014－12－19；

：2015－03－31

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81271125，81470733）

王娟（1987－），女，漢族，山西長治人。碩士生（導(dǎo)師：何文喜）

何文喜，E－mail：hewenxi＠fmmu．edu．cn