蒙藥扎沖十三味丸對大鼠缺血性腦損傷后海馬組織細(xì)胞凋亡影響的初步研究*

劉鑫 陶春 林琳

扎沖十三味丸出自《蒙醫(yī)經(jīng)典》[1]，又名嘎日迪十三，在蒙醫(yī)臨床中是最常用的首選傳統(tǒng)方劑之一，主要用于心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[2]，經(jīng)臨床證實(shí)，對于腦血栓、腦梗死、腦萎縮、腦中風(fēng)偏癱、言語不清等腦血管病、心肌缺血等疾病有明確療效[3-6]。扎沖十三味丸目前雖然在臨床治療方面已經(jīng)顯示出較為確切的療效，近年來很多學(xué)者致力于從作用機(jī)理、作用靶點(diǎn)等方面為此藥提供理論依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)扎沖十三味丸可以保護(hù)血腦屏障，可以減輕氧自由基對細(xì)胞的損害[7]，減輕缺血后腦組織水腫[8]。明確此藥的作用機(jī)理，對于扎沖十三味丸的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注后的損傷關(guān)系密切，且在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。腦缺血及再灌注損傷后及時進(jìn)行抗凋亡治療具有重要意義。本研究擬通過誘發(fā)小鼠腦梗死缺血缺氧引起神經(jīng)細(xì)胞損傷后，從凋亡的角度研究扎沖十三味丸對腦缺血性損傷的保護(hù)性，研究其作用機(jī)理，從細(xì)胞和分子水平上闡明蒙成藥扎沖十三味丸的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 扎沖十三味丸，PBS，annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自上海貝博生物試劑公司），BD Calibur流式細(xì)胞儀，BD公司產(chǎn)品；bax/bcl-2 Elisa試劑盒（購自天津海晶精細(xì)化工廠），酶標(biāo)儀，MK3型，芬蘭雷勃公司。

1.2 動物與分組 清潔級SD大鼠，雌雄均可，共72只，重量180~210 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（許可證號吉2007-0003），動物分籠飼養(yǎng)（環(huán)境溫度24~26 ℃，濕度60%~70%），自由飲水，術(shù)前12 h禁食。將大鼠隨機(jī)分為三組：正常對照組、模型組、給藥組。模型組和給藥組根據(jù)術(shù)后處死時間不同，又分作1、3、5、7 d組。每組各8只大鼠。

1.3 模型制備 制作SAH模型，采用大鼠自體顱內(nèi)血經(jīng)枕大池二次注射。配制10%水合氯醛（0.35/100 g）于腹腔注射麻醉后，在操作臺上將大鼠俯臥位固定，安爾碘常規(guī)消毒，項(xiàng)部備皮。取左右耳根部連線的中點(diǎn)，沿正中線縱向切開頸部皮膚，將枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜暴露于視野下，用1 mL注射器針頭將環(huán)枕膜刺破后再微微推進(jìn)至枕大池，待有腦脊液流出后，自大鼠左眼球后靜脈叢抽取0.3 mL自體血，無需抗凝，隨后按照0.15 mL/100 g（體重）標(biāo)準(zhǔn)，將自體非抗凝血以0.1 mL/min的注射速度緩慢注入大鼠枕大池。用明膠海綿壓迫穿刺點(diǎn)3 min，縫合切口。將大鼠俯臥位30 min，并保持頭低30°體位，以利于血液凝固并沉積在腦底血管周圍。待大鼠保溫復(fù)蘇至清醒后，可自由飲食飲水。48 h后同樣操作方法制作大鼠腦梗死模型。嘎日迪-13味丸組在手術(shù)第2天開始給嘎日迪-13味丸灌胃。在第2次注射后第1、3、5、7天取腦待檢。

1.4 模型成功標(biāo)志 待大鼠自然蘇醒后，根據(jù)Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，對大鼠神經(jīng)功能缺失進(jìn)行評分。無明顯損傷癥狀者為0分；對側(cè)前爪不能完全伸展者為1分；行走時肢體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)者為2分；行走時向?qū)?cè)傾倒者為3分；意識喪失，不能自發(fā)行走者為4分。評分結(jié)果在1~3分內(nèi)的鼠為有效模型。剔除未入選及死亡的大鼠，每組剩余6只。

1.5 給藥方法 按照2%的濃度，將扎沖十三味丸用蒸餾水配制成溶液，灌胃給藥，每日1次，模型組大鼠均喂予蒸餾水。正常對照組大鼠置同一環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.6 標(biāo)本取材 待第2次注血后，在第1、3、5、7天分別采用斷頭法處死各組大鼠，迅速取出腦海馬組織。全部取材過程置于冰盒上進(jìn)行。

1.7 凋亡細(xì)胞的檢測 將取出的海馬組織置于金屬細(xì)胞篩上，用玻璃注射器芯研磨，并用顯微鏡下觀察，待研磨成單細(xì)胞后，加入PBS離心10 min，棄上清后取沉淀用PBS稀釋至10 mL，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)400目細(xì)胞篩過濾，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，按照試劑盒操作步驟，取1 mL細(xì)胞懸液，依次標(biāo)記annexin-V-FITC和PI，上機(jī)檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.8 Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)檢測 取海馬組織研磨后離心的上清液，加50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，然后立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃溫育1 h，洗滌后每孔加入60 μL的親和鏈酶素-HRP，37 ℃溫育30 min，洗滌后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃溫育10 min。加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的OD值。計(jì)算Bcl-2、Bax蛋白的濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以（x-±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果比較 模型組各時間點(diǎn)中細(xì)胞凋亡率均高于正常對照組（P<0.05），造模成功；給藥組中，各時間點(diǎn)與相應(yīng)時間點(diǎn)模型組比較，凋亡率顯著降低，與正常對照組相比較亦有明顯降低（P<0.05）。見表1。

2.2 各組Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)檢測比較 模型組Bax蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組的（40.53±3.39）pg/mL；給藥組與模型組相比較，Bax蛋白表達(dá)減少，其中1 d和5 d組有顯著差異（P<0.05）。模型組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于正常對照組的（24.71±1.44）pg/mL；給藥組與模型組相比較，各時間點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)均增高（P<0.05）。見表2。

表1 蒙藥扎沖十三味丸對海馬組織流式細(xì)胞儀的檢測數(shù)據(jù)（±s） %

表1 蒙藥扎沖十三味丸對海馬組織流式細(xì)胞儀的檢測數(shù)據(jù)（±s） %

組別 7 d 5 d 3 d 1 d給藥組（n=6）0.43±0.19 0.30±0.35 0.20±0.02 0.13±0.09模型組（n=6）7.05±2.60 2.08±0.80 3.94±2.47 1.50±0.35正常對照組（n=6）1.13±0.14 1.13±0.14 1.13±0.14 1.13±0.14

表2 蒙藥扎沖十三味丸對缺血缺氧腦海馬組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響（±s） pg/mL

表2 蒙藥扎沖十三味丸對缺血缺氧腦海馬組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響（±s） pg/mL

*與模型組比較，P<0.05

Bcl-2蛋白組別 Bax蛋白1 d 3 d 5 d 7 d 1 d 3 d 5 d 7 d模型組（n=6） 74.05±14.15 57.78±04.24 65.53±10.46 66.40±9.40 18.56±4.62 16.23±2.66 17.85±1.70 16.17±1.74給藥組（n=6） 49.42±7.64* 42.42±1.80 42.54±2.03* 40.98±1.88 63.37±26.98*90.30±21.14*70.83±27.05* 126.10±26.48*

3 討論

缺血性腦損傷中細(xì)胞死亡機(jī)制包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，壞死發(fā)生迅速且不可逆，目前沒有辦法可以干擾這一過程。而在梗死灶周邊的缺血半暗帶區(qū)內(nèi)，細(xì)胞壞死和凋亡共存，如不能進(jìn)行及時有效的治療，會向著不可逆性損傷發(fā)展，細(xì)胞啟動凋亡程序存在一段時間延擱，抓住這段機(jī)間進(jìn)行有效治療可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)缺血后的腦損傷。

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量變化來探討扎沖十三味丸在缺血發(fā)生后對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，正常對照組仍有少量凋亡細(xì)胞，可能是腦組織細(xì)胞生長發(fā)育過程中發(fā)生的生理性凋亡以及手術(shù)刺激引起的凋亡；模型組各時間點(diǎn)凋亡細(xì)胞均較正常對照組顯著增多，證實(shí)腦缺血引發(fā)細(xì)胞損傷過程中，細(xì)胞凋亡確實(shí)是一種重要損傷形式；扎沖十三味丸給藥組所有時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率均顯著少于與模型組，顯示扎沖十三味丸可以明顯降低腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度 ，通過抗凋亡的機(jī)制對腦神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。本課題組其他實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)[10]扎沖十三味丸能夠減小腦組織梗死范圍，給藥組腦梗死范圍比實(shí)驗(yàn)組有明顯減小，說明扎沖十三味丸可以通過緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡，達(dá)到逆轉(zhuǎn)缺血性損傷的目的，起到對腦缺血損傷神經(jīng)的保護(hù)作用。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要有兩條途徑，凋亡受體途徑及線粒體途徑[11]。胞外刺激和胞內(nèi)刺激往往啟動線粒體途徑[12]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞質(zhì)面上，Bax蛋白能在線粒體膜上形成孔道，使細(xì)胞色素C等小分子物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生，Bcl-2蛋白能通過封閉孔道，調(diào)控線粒體膜電位等方式抑制凋亡[13]。而本實(shí)驗(yàn)選擇Bcl-2蛋白家族成員中Bax蛋白和Bcl-2蛋白進(jìn)行研究，Elisa檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠腦梗死灶中，對于促進(jìn)凋亡的Bax蛋白，蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組，提示缺血大鼠腦組織的損傷中有Bax促凋亡機(jī)制的參與，而給藥組與模型組相比較，Bax蛋白表達(dá)量減少。說明通過藥物治療后，促凋亡蛋白表達(dá)下降。在檢測抑制凋亡的Bcl-2蛋白時顯示，模型組蛋白表達(dá)水平均低于正常對照組，給藥組蛋白表達(dá)量均顯著高于模型組，以上結(jié)果提示扎沖十三味丸可以增加bcl-2蛋白表達(dá)量，同時下調(diào)bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2同源二聚體形成，通過線粒體凋亡途徑從而發(fā)揮抗凋亡作用。

從上述結(jié)果可以看出，輔以扎沖十三味丸能夠更大限度的緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而起到保護(hù)腦細(xì)胞及神經(jīng)功能的作用。這一結(jié)果符合目前廣泛采用的急性腦梗死治療的搶救原則，即降低病灶半暗區(qū)中受損腦細(xì)胞的凋亡程度[14]。同時，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，能夠緩解腦缺血恢復(fù)血液再灌注后的損傷[15-19]。綜上所述，扎沖十三味丸可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，阻止梗死范圍擴(kuò)大，達(dá)到逆轉(zhuǎn)缺血性損傷的目的，同時減輕恢復(fù)血液再灌注后的進(jìn)一步損傷。在腦缺血發(fā)生后，應(yīng)用扎沖十三味丸能夠?qū)θ毖阅X損傷海馬組織中的神經(jīng)細(xì)胞起到很好的保護(hù)作用。

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