正交試驗(yàn)法優(yōu)選真武湯的微波提取工藝

任燕　何興會(huì)

[摘 要] 目的：優(yōu)選出真武湯的微波提取最佳工藝。方法：采用微波提取方法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)兩者結(jié)合考察了乙醇提取濃度、提取時(shí)間、微波火力、料液比對(duì)真武湯中芍藥苷得率的影響，從而優(yōu)選出最優(yōu)提取工藝。結(jié)果：真武湯提取工藝最佳條件為：乙醇濃度為60%，微波時(shí)間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10。結(jié)論：本研究將為真武湯的劑型開(kāi)發(fā)等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 真武湯；芍藥苷；微波提?。徽粚?shí)驗(yàn)

[中圖分類號(hào)]R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [文章編號(hào)]1007-8517（2015）06-0008-02

真武湯出自《傷寒論》，系張仲景針對(duì)少陰腎陽(yáng)虧虛，氣不化水，水氣內(nèi)停而設(shè)。全方由炮附子、白術(shù)、茯苓、生姜、芍藥等五味藥組成，具有扶陽(yáng)抑陰、化氣行水的效果，適用于脾腎陽(yáng)虛、水氣內(nèi)停等證，為溫陽(yáng)利水之經(jīng)典方。后世醫(yī)家對(duì)本方進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，目前已突破了水病的范圍，用本方治療多個(gè)系統(tǒng)的疾病，如：慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、風(fēng)心病、冠心病、充血性心力衰竭、慢性胃腸炎、肝硬化腹水、慢性腎炎、內(nèi)耳性眩暈、血栓閉塞性脈管炎等疾病，療效令人滿意。該方雖應(yīng)用很廣，但對(duì)該方的提取工藝還未見(jiàn)有研究，從而也制約該方的制劑開(kāi)發(fā)，故本文通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開(kāi)發(fā)該方新制劑奠定一定基礎(chǔ)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 WP700L17微波爐；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-VIS分光光度計(jì)（UV-2450，日本島津公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東光學(xué)儀器廠）。

1.2 材料 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；所用試劑均為分析純；中藥材炮附子、白術(shù)、茯苓、芍藥購(gòu)于貴陽(yáng)市藥材公司，生姜購(gòu)于菜市場(chǎng)；炮附子、白術(shù)、茯苓、芍藥用粉碎機(jī)粉碎得藥材粗顆粒；生姜切塊，備用。

2 方法

2.1 芍藥苷含量得率的測(cè)定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 精密稱取100℃干燥恒重的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品4.8mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1920mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5ml分別置于10ml容量瓶中，編號(hào)為1、2、3、4、5、6，加入甲醇定容至10ml，搖勻，甲醇做空白對(duì)照。

2.1.2 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將配制好的對(duì)照品溶液進(jìn)行波長(zhǎng)確定，選出最大波長(zhǎng)，最后確定最大波長(zhǎng)為230nm。在230nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度對(duì)吸收值做線性回歸，得出回歸方程：Y=30.007X-0.0273，R2=0.9994，其中X是芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，Y是吸光度值。

2.1.3 供試品的制備 準(zhǔn)確稱取按真武湯復(fù)方處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/3（既茯苓3.00g，芍藥3.00g，生姜3.00g，白術(shù)2.00g，炮附子1.40g）至250ml錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇溶液后置微波爐中提取，冷卻后補(bǔ)足失去的乙醇量，濾過(guò)，精確量取一定濾液（V），蒸發(fā)至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 芍藥苷得率測(cè)定 取供試品溶液于230nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，然后帶入所得線性回歸方程中計(jì)算，即可得樣品中芍藥苷的濃度，經(jīng)進(jìn)一步計(jì)算就得其得率。芍藥苷得率的計(jì)算公式：得率=X×100×（25/V）×10-3/W*100%，式子中X為樣品液中芍藥苷的濃度（mg/ml），V為精確量取蒸發(fā)的液體（ml），W為真武湯藥材總質(zhì)量。

2.2 單因數(shù)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間的影響 分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術(shù)1.00g，炮附子0.70g），各六份，混勻。按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火（P=50），微波提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6min，得提取液，最后測(cè)定芍藥苷的吸光度。

2.2.2 微波火力的影響 分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術(shù)1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波時(shí)間為3min，微波火力分別為微火（P=10）、中微火（P=30）、中火（P=50）、中高火（P=80）、最大火（P=100），得提取液，最后測(cè)定芍藥苷的吸光度。

2.2.3 料液比的影響 分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術(shù)1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。分別按料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火（P=50），微波提取時(shí)間為3min，得提取液，最后測(cè)定芍藥苷的吸光度。

2.2.4 乙醇濃度的影響 分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術(shù)1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。按料液比為1∶15分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火（P=50），微波提取時(shí)間為3min，得提取液，最后測(cè)定芍藥苷的吸光度。

2.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨著提取時(shí)間的增加芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在4min時(shí)有最大值；隨著微波火力的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在微波火力為中高火時(shí)有最大值；隨著料液比的增大，芍藥苷的吸光度值逐漸增大，后趨于平衡，其中在1∶20、1∶25時(shí)，趨于平衡；隨著乙醇濃度的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在濃度為70%時(shí)有最大值。

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn) 分別稱取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/3（既茯苓3.00g，芍藥3.00g，生姜3.00g，白術(shù)2.00g，炮附子1.40g），各9份，混勻，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 由表2可知，根據(jù)K值各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響按大小次序排列為A>D>B>C，即乙醇濃度>料液比>微波時(shí)間>火力。由方差分析F值大小可得從真武湯中提取芍藥苷的最佳條件為：A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時(shí)間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 取上述處方藥材三份，分別按上述最佳工藝條件A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時(shí)間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)表3。

由表3可知，按照正交試驗(yàn)所優(yōu)選而得的最佳工藝進(jìn)行提取試驗(yàn)，三次結(jié)果芍藥苷含量均處于較高水平，這說(shuō)明該最佳工藝是穩(wěn)定可行的。

3 討論

真武湯為經(jīng)典方劑，臨床用于心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、婦科疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等?，F(xiàn)代研究證實(shí)，該方不但具有利尿、強(qiáng)心的作用，還有保護(hù)受損心肌、消除自由基、提高機(jī)體應(yīng)激、促進(jìn)新陳代謝抗衰老等作用[1]。李景巍[2]、劉崇新[3]、荊世常[4]、何幼斌[5]等應(yīng)用真武湯在臨床上取得很好療效。該方雖應(yīng)用很廣，但未見(jiàn)該方提取工藝的研究，從而也制約該方的制劑開(kāi)發(fā)。另外，微波提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等許多優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物提取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)[6-8]。因此本文選擇以乙醇濃度、微波時(shí)間、微波火力、料液比四個(gè)因素對(duì)真武湯中芍藥苷的提取工藝進(jìn)行考察，采用單因素以及正交實(shí)驗(yàn)兩者相結(jié)合，以芍藥苷為檢測(cè)指標(biāo)，考察真武湯中芍藥的提取工藝。吳謙認(rèn)為[9]：“真武湯尤妙在芍藥之酸收，仲景之旨微矣。蓋人之身陽(yáng)根于陰，若徒以辛熱補(bǔ)陽(yáng)，不少佐以酸收之品，恐真陽(yáng)飛越矣，用芍藥者，是亟收陽(yáng)氣歸根于陰也，于此推之，則可知誤服青龍致發(fā)汗亡陽(yáng)者，所以于補(bǔ)陽(yáng)藥中之必需芍藥也?！彼詸z測(cè)芍藥苷的含量具有代表性，芍藥苷含量多少與該方的有效部位的溶出度有密切關(guān)系。故本實(shí)驗(yàn)用紫外分光光度法測(cè)定芍藥苷得率，方法簡(jiǎn)單、易操作，且乙醇提取溶出的雜質(zhì)少、溶劑可回收、比較經(jīng)濟(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳的提取工藝為：乙醇濃度為60%，微波時(shí)間3min，微波火力中高火，料液比1∶10；且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該最佳工藝是穩(wěn)定可行的。本文通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開(kāi)發(fā)該方新制劑奠定一定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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