聚丙烯酸功能化LaF3:Ce3 + /Tb3 +熒光探針測定鮭魚精DNA

張藝，李紫薇，高紅艷

(伊犁師范學院 化學與生物科學學院 新疆凝聚態(tài)相變與微結(jié)構(gòu)實驗室，新疆 伊寧 835000)

目前，常用的化學分析方法［1］有色譜分析法、電化學分析法等，但色譜分析法對檢測人員的技術(shù)要求較高，需要較大的設(shè)備投入、成本高、操作耗時等。電化學分析法的靈敏度、選擇性較差。所以迫切需要發(fā)展高靈敏度、選擇性好、方便操作和低成本的分析方法。熒光分析法可以滿足上述要求，而成為較活躍的檢測手段［2］。傳統(tǒng)的熒光材料有有機染料、熒光蛋白、量子點等，但它們大都存在光漂白、信號強度低、穩(wěn)定性差、低毒等缺點，限制了其在生物和環(huán)境檢測領(lǐng)域的深入應(yīng)用。所以尋找低毒性、良好化學穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率的新型熒光材料十分必要。

功能化的稀土發(fā)光材料在生物和環(huán)境檢測領(lǐng)域的應(yīng)用是利用材料表面的特征官能團(氨基、羧基、巰基等)與待測物質(zhì)間的能量轉(zhuǎn)移或生成新的熒光物質(zhì)而建立起來的熒光淬滅或熒光增強的機理［3-5］。李丹［6］用巰基乙酸(TGA)為表面活性劑與油胺中合成的NaYF4納米晶進行配體交換，利用巰基與稀土Y3+配位，另一端的羧基可以增強其水溶性，并使發(fā)光納米材料具有生物活性，最后采用MTT 比色法對肝癌細胞進行了毒性分析。

本文是采用簡單易操作的溶劑熱法制備出LaF3:Ce3+/Tb3+材料，并用聚丙烯酸(PAA)對發(fā)光材料進行功能化，使LaF3:Ce3+/Tb3+表面包裹上生物相容性官能團羧基(─COOH)，基于DNA 對COOH-LaF3:Ce3+/Tb3+材料的熒光猝滅作用，定量分析了鮭魚精DNA(hs-DAN)，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

La (NO3)3· 6H2O、Tb (NO3)3· 6H2O、Ce(NO3)3·6H2O、Na2HPO4、NaH2PO4、CH3CH2OH、HOCH2CH2OH、NaF 均為分析純;鮭魚精DNA，標準品;實驗用水為二次蒸餾水。

CYIYE-QI 型移液器;FA2104N 型電子天平;79-1 型磁力加熱攪拌器;pHSJ-5 型pH 計;GZX-9146MBE 型數(shù)顯鼓風干燥箱;TGL-16C 型高速臺式離心機;XRD-6000 型X-射線粉末衍射儀;LS-55 型熒光分光光度計;Prestige-21 型紅外光譜儀(KBr 壓片)。

1.2 LaF3:Ce3+ /Tb3+材料的制備

攪拌條件下，在10 mL 乙二醇和20.00 mL 無水乙醇的混合溶劑中分別加入0.9 mL 的La(NO3)3·6H2O、50 μL Tb(NO3)3·6H2O 和50 μL Ce(NO3)3·6H2O。攪拌均勻后，逐滴加入2 mL NaF 水溶液，再繼續(xù)攪拌30 min。然后轉(zhuǎn)移至帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，將其放入烘箱，160 ℃條件下加熱12 h。反應(yīng)結(jié)束后，待溫度降到室溫，倒去反應(yīng)釜里上清液，釜底的白色固體就是LaF3:Ce3+/Tb3+沉淀，將其分散在水中，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心8 min，同樣的方法用蒸餾水洗滌3 次，除去殘留的溶劑，80 ℃烘干樣品，備用。

1.3 聚丙烯酸(PAA)對LaF3:Ce3+ /Tb3+材料的包裹

稱取0. 112 8 g LaF3:Ce3+/Tb3+樣品，加到20 mL 無水乙醇和10 mL 蒸餾水混合溶液中，再加入1 mL 聚丙烯酸，超聲48 h 后，得到PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+功能材料。用去離子水離心清洗3 次，離心清洗后的樣品超聲分散在50 mL 去離子水中，樣品濃度為0.011 52 mol/L(以LaF3的物質(zhì)的量濃度計算)，備用。

1.4 PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+功能材料測定鮭魚精DNA

在10 mL 容量瓶中分別加1 mL PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+(0.011 52 mol/L)樣品，5 mL 蒸餾水，再分別加0，60，100，500，1 000，2 500 μL 的100 μg/mL鮭魚精DNA 水溶液，用PBS 緩沖溶液調(diào)pH 為5.5，最后用蒸餾水定容至10 mL(樣品濃度為1. 1 ×10－3mol/L)。用熒光分光光度計測其熒光強度，以275 nm 為激發(fā)波長，531 nm 為發(fā)射波長。PAALaF3:Ce3+/Tb3+制備及與DNA 作用見圖1。

圖1 PAA 包裹LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體及與DNA作用示意圖Fig.1 Schematic illustration of PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+ and detection for hs-DNA

2 結(jié)果與討論

2.1 LaF3:Ce3+ /Tb3+納米晶的XRD 表征

圖2 為制備的LaF3:Ce3+/Tb3+晶體的X 射線衍射圖譜。

圖2 LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體的XRD 圖Fig.2 X-ray diffraction patterns of LaF3:Ce3+ /Tb3+ crystals

由圖2 可知，譜圖的衍射峰分別對應(yīng)(110)、(111)、(112)、(113)、(212)、(220)、(310)、(320)、(115)、(411)、(403)、(314)等晶面。其衍射峰與標準卡片號為72-1435 立方相的LaF3晶體相符合，無明顯雜質(zhì)峰，說明純度高、結(jié)晶好。

2.2 紅外譜圖分析

圖3 給出了PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+晶體紅外吸收譜圖。

由圖3 可知，3 440 cm－1處吸收峰對應(yīng)著─COOH 基的νO─H峰，2 954 cm－1為PAA 中飽和烷烴─CH2的特征峰，1 726 cm－1處吸收峰是─COOH 基中的特征峰，在1 577 cm－1和1 464 cm－1兩峰為─COOH 基中ν─COO的對稱和不對稱伸縮振動峰。1 429 cm－1為νC─O特征峰，說明聚丙烯酸中的─COOH 與La 發(fā)生了鍵合。由此，可以確定聚丙烯酸已成功修飾于LaF3:Ce3+/Tb3+晶體外表面上。

圖3 PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+ crystals

2.3 鮭魚精DNA(hs-DNA)的測定

鮭魚精DNA(hs-DNA)的測定結(jié)果見圖4，譜線a ～f 給出了不同摩爾濃度hs-DNA 存在時，體系熒光強度的變化。結(jié)果表明，pH =5.5，λem/λex=531/275 nm 時，體系的熒光強度隨hs-DNA 濃度的增加呈線性降低。a ～f 分別是hs-DNA 濃度為0.0，0.6，1.0，5.0，10.0，25.0 μg/mL，LaF3:Ce3+/Tb3+濃度為1.92 ×10－3mol/L 的熒光譜圖。下圖為PAALaF3:Ce3+/Tb3+熒光強度與hs-DNA 濃度之間的線性關(guān)系。

圖4 hs-DNA 體系熒光光譜Fig.4 Luminescent spectra of hs-DNA system

由圖4 可知，在濃度為0.6 ～25 μg/mL 范圍內(nèi)，ΔF 與hs-DNA 濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程ΔF =113.9－1.5c，檢測限為0.97 μg/mL，RSD為0.97%。相關(guān)系數(shù)R=0.998 2。寬的線性范圍、低的檢測限表明此種方法對DNA 的定量分析效果良好。hs-DNA 之所以對PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+材料有熒光猝滅現(xiàn)象，是因為功能化的材料表面有羧基可以與核酸上的氨基鍵合，然后Tb3+或Ce3+的激發(fā)電子與DNA 之間的傳遞而導致體系發(fā)生熒光猝滅［7］。

2.4 pH 值的選擇

考察了pH 3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5 八種不同緩沖溶液對體系熒光強度的影響，結(jié)果見圖5。在10 mL 容量瓶中分別加1 mL PAALaF3:Ce3+/Tb3+樣品(濃度為1. 1 ×10－3mol/L)，1 mL 鮭魚精DNA，用PBS 緩沖溶液調(diào)pH 值，最后蒸餾水定容。

圖5 酸度對體系熒光強度的影響Fig.5 Effect of pH on the quenching of the fluorescence

由圖5 可知，體系的熒光強度隨pH 值的增加略有增強，pH 5.5 時，熒光最強，當pH 值＞5.5 時，體系的熒光強度反而降低。故本實驗選擇pH 5.5時測定體系。

2.5 共存物的干擾

考察了當hs-DNA 濃度為5.0 μg/mL 時，不同濃度的干擾物質(zhì)對測定的影響，見表1。

表1 共存物質(zhì)對測定的干擾Table 1 Tests for the interference of coexisting substances

由表1 可知，大部分共存物質(zhì)對hs-DNA 的分析的干擾都很小。表明該方法有較好的選擇性。

3 結(jié)論

用簡單的溶劑熱方法制備了LaF3:Ce3+/Tb3+晶體，利用超聲微乳包裹技術(shù)將聚丙烯酸包裹在LaF3:Ce3+/Tb3+材料表面，合成出羧基功能化的PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+材料。這樣增大了材料的水溶性及生物相容性，據(jù)此建立了與鮭魚精DNA 之間的熒光探針，利用熒光猝滅法，對核酸進行了定量測定，靈敏度和選擇性較好。該方法可以用于生物樣品的測定。參考文獻:

［1］ 高鴻. 分析化學前沿［M］. 北京:科學出版社，1999:370.

［2］ 王歡，高奕紅，張萍.熒光傳感器及其分子識別作用的研究進展［J］.應(yīng)用化工，2014，43(4):718-728.

［3］ Wang L Y，Yan R X，Hou Z Y，et al. Fluorescence resonant energy transfer biosensors based on upconversion luminescent nanoparticles［J］. Angew Chem Int Ed，2005，44:6054-6057.

［4］ Chen Hongqi，Yuan Fei，Xu Yong，et al.Simple and sensitive detection method for cobalt(Ⅱ)in water using CePO4:Tb3+nanocrystals as fluorescent probes［J］.Spectrochimica Acta Part A，2013，107:151-155.

［5］ Liu J N，Bu W B，Pan L M，et al.NIR-triggered anticancer drug delivery by upconverting nanoparticles with integrated azobenzene-modified mesoporous silica［J］. Angewandte Chemie，2013，125:4471-4475.

［6］ 李丹.巰基乙酸修飾對六角相NaYF4:Yb，Er 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的影響［D］.長春:吉林大學，2010.

［7］ Dong Ling，Yang Z H，Zhang Y，et al. Novel luminescent nanoparticles for DNA detection［J］.Spectrochimica Acta Part A，2010，75:1530-1534.