無(wú)溶劑體系中酶法催化微藻油脂乙酯化制備生物柴油工藝研究

庫(kù)流鵬，賀珧珈，姚杰，曹海，閆云君

(1.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074;2.華中科技大學(xué) 中歐清潔與可再生能源學(xué)院，湖北 武漢 430074)

為了緩解石油供應(yīng)和環(huán)境污染問(wèn)題，生物柴油作為一種可再生的生物燃料越來(lái)越受到人們青睞。但是，與傳統(tǒng)的石油相比，生物柴油的成本偏高，缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。生物柴油制備［1-2］過(guò)程中大部分成本來(lái)自于原材料。一般地，植物油原料［3］成本達(dá)到總成本的80%左右。以微藻為原料制備生物柴油通常被認(rèn)為能夠有效降低成本，因?yàn)槲⒃寰哂猩L(zhǎng)周期短、生物產(chǎn)量高和油脂含量高等突出優(yōu)點(diǎn)［4］。此外，微藻的培養(yǎng)不占用耕地，可在工廠的煙囪甚至公路附近設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)微藻的生物反應(yīng)器［5］來(lái)吸收排放的廢氣產(chǎn)生油脂，這對(duì)于改善環(huán)境污染有著積極作用。Chisti［6］通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行工程計(jì)算，得出以微藻為原料制備的生物柴油是傳統(tǒng)石化柴油最有潛力的替代品。同時(shí)，微藻也是多不飽和脂肪酸的重要來(lái)源，多不飽和脂肪酸在營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［7］有著重要應(yīng)用價(jià)值。目前，通過(guò)魚(yú)油資源獲取多不飽和脂肪酸已難以滿足人們的龐大需求，開(kāi)發(fā)微藻作為新的資源有著良好的發(fā)展前景［8］。

雖然關(guān)于微藻的研究近年已成為熱點(diǎn)，但關(guān)于微藻油脂乙酯化制備生物柴油的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文研究了Novozym 435 脂肪酶［9］催化藻油和乙醇的轉(zhuǎn)酯化技術(shù)工藝，并采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)其反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。反應(yīng)選取乙醇為?；荏w，因?yàn)榍捌趯?duì)藻油性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其與乙醇的互溶性較好，且乙醇可通過(guò)生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)，是一種清潔可再生、無(wú)毒無(wú)害的資源，使得工藝過(guò)程更為環(huán)保。體系中不添加其它有機(jī)溶劑［10］，產(chǎn)物生物柴油類型為脂肪酸乙酯，也能用于多不飽和脂肪酸富集等高值化過(guò)程。本文探索了微藻生物柴油的制備條件，同時(shí)為其高值化應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

固定化Novozym 435 脂肪酶，購(gòu)自丹麥諾維信公司;藻油，購(gòu)自本地市場(chǎng)，其脂肪酸組成見(jiàn)表1;脂肪酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純;無(wú)水乙醇、正己烷等均為分析純。

表1 藻油的脂肪酸組成Table 1 Composition of the microalgae oil

AL104 型電子天平;UPT-IV-10T 純水儀;HPINNOWAX19091-133 型氣相色譜柱;GC9790 型氣相色譜儀;WY211B 恒溫?fù)u床;ULT1786-3-V39 超低溫冰箱;5415D 型離心機(jī);Vortex-2 漩渦振蕩儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)中主要考察了加酶量、反應(yīng)時(shí)間、醇油摩爾比、反應(yīng)溫度和轉(zhuǎn)速等因素對(duì)于脂肪酸乙酯得率的影響。稱取藻油5.0 g 于25 mL 的磨口三角瓶中，按照一定的比例加入無(wú)水乙醇，通N2保護(hù)，蓋上塞子密封后置于恒溫?fù)u床中混合均勻，加入一定量的脂肪酶，繼續(xù)置于恒溫?fù)u床中振蕩反應(yīng)一定時(shí)間。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選定酶用量、反應(yīng)時(shí)間、醇油摩爾比和溫度4 個(gè)因素，采用Box-Behnken 法設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS 9.2 進(jìn)行分析，擬合出回歸模型的二次方程并進(jìn)行方差分析，根據(jù)得到最優(yōu)的預(yù)測(cè)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?；貧w模型如下:

1.2.3 乙酯得率計(jì)算 取100 μL 反應(yīng)液離心，取10 μL 上層清液，加入290 μL 十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)，再加入300 μL 正己烷混合均勻后用于氣相色譜分析。氣相色譜柱:HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣N2，柱流速2 mL/min，尾吹氣體流速30 mL/min，分流比30∶1，柱溫230 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，進(jìn)樣量1 μL，升溫程序?yàn)?00 ℃保持1 min，以3 ℃/min 升至240 ℃，保持10 min。乙酯得率的計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 Novozym 435 脂肪酶用量對(duì)乙酯得率的影響在反應(yīng)溫度40 ℃，乙醇和藻油摩爾比3∶1，轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)時(shí)間12 h 的條件下，考察了加酶量基于油質(zhì)量在2% ～8%范圍內(nèi)對(duì)生物柴油得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 脂肪酶用量對(duì)乙酯得率的影響Fig.1 The effect of enzyme dosage on FAEE yield

由圖1 可知，當(dāng)加酶量從2%上升到5%時(shí)，乙酯得率呈上升趨勢(shì);當(dāng)加酶量超過(guò)5%時(shí)，乙酯得率不再上升［11］，甚至略微下降?？赡茉蚴?，在一定的范圍內(nèi)加入酶量越大，酶與底物的接觸越充分，越有利于反應(yīng)的進(jìn)行;當(dāng)加酶量增加到一定程度時(shí)，酶相對(duì)于底物達(dá)到飽和，所以再增加酶量不能提高轉(zhuǎn)化率。另外，酶量過(guò)大時(shí)容易發(fā)生團(tuán)聚，不利于酶與底物的接觸，反而會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。因此，最佳加酶量選定為5%。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯得率的影響 在加酶量5%，乙醇和藻油摩爾比3∶1，反應(yīng)溫度40 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min 的條件下，測(cè)定了不同反應(yīng)時(shí)間下的乙酯得率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，在0 ～16 h 反應(yīng)速率隨著時(shí)間的增加而逐漸下降，16 h 后反應(yīng)達(dá)到平衡，轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最大，且保持不變，符合酶催化反應(yīng)固有規(guī)律［12］。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為16 h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯得率的影響Fig.2 The effect of reaction time on FAEE yield

2.1.3 醇油摩爾比對(duì)乙酯得率的影響 理論上，酯交換反應(yīng)的醇油摩爾比為3∶1。但酯交換反應(yīng)為可逆反應(yīng)，過(guò)量的乙醇會(huì)促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，從而增加乙酯得率。因此，在加酶量5%，反應(yīng)時(shí)間16 h，反應(yīng)溫度40 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下，研究了醇油摩爾比在2∶1 ～6∶1 范圍內(nèi)對(duì)乙酯得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 醇油摩爾比對(duì)乙酯得率的影響Fig.3 The effect of molar ratio of ethanol to oil on FAEE yield

由圖3 可知，在醇油摩爾比為4∶1 時(shí)乙酯得率最高，當(dāng)醇油摩爾比高于4∶1 時(shí)，乙醇對(duì)酶開(kāi)始顯現(xiàn)毒害作用，不利于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的進(jìn)行。因此，最佳醇油摩爾比選定為4∶1。

2.1.4 轉(zhuǎn)速對(duì)乙酯得率的影響 在加酶量5%，反應(yīng)時(shí)間16 h，反應(yīng)溫度40 ℃，醇油摩爾比4∶1 的條件下，檢測(cè)了不同搖床轉(zhuǎn)速條件下的乙酯得率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，在100 ～200 r/min 轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，乙酯得率隨轉(zhuǎn)速的增加而提高，這是因?yàn)樵黾愚D(zhuǎn)速有利于反應(yīng)底物充分混合。在轉(zhuǎn)速200 ～300 r/min范圍內(nèi)，乙酯得率基本不受轉(zhuǎn)速的影響?？紤]到增加轉(zhuǎn)速會(huì)加大搖床功率，且過(guò)高轉(zhuǎn)速可能會(huì)損傷固定化酶結(jié)構(gòu)從而減少其使用壽命，因此最佳轉(zhuǎn)速設(shè)定為200 r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)乙酯得率的影響Fig.4 The effect of rotating speed on FAEE yield

2.1.5 反應(yīng)溫度對(duì)乙酯得率的影響 酶催化反應(yīng)都有最適的催化溫度，為了確定本反應(yīng)的最適溫度，在加酶量5%，反應(yīng)時(shí)間16 h，醇油摩爾比4∶1，轉(zhuǎn)速200 r/min 的條件下，考察了在25 ～55 ℃范圍內(nèi)乙酯得率隨溫度變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)乙酯得率的影響Fig.5 The effect of reaction temperature on FAEE yield

由圖5 可知，該反應(yīng)的最適溫度為45 ℃，升高或降低溫度都會(huì)使酶的活性下降，不利于反應(yīng)進(jìn)行。當(dāng)溫度較低時(shí)，乙醇和藻油互溶性不好，增加了傳質(zhì)阻力，也會(huì)對(duì)反應(yīng)造成不利影響。因此，最佳反應(yīng)溫度選定為45 ℃。

2.2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析

Box-Behnken 設(shè)計(jì)的因素及水平見(jiàn)表2，得到的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 單因素及其水平Table 2 Independent variables and levels

得到的數(shù)據(jù)經(jīng)SAS 9.2 軟件分析，得到二次回歸方程如下:

表3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of Box-Behnken experiments

模型的可靠性依據(jù)表3 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

由表4 可知，在a=0.05 的水平上，模型的P 檢驗(yàn)值＜0.000 1，表明該回歸模型是高度顯著的。失擬項(xiàng)的P 檢驗(yàn)值為0.196 9，表明相對(duì)于純誤差的影響，失擬項(xiàng)的影響是不顯著的。該模型的決定系數(shù)R2=0.981 9，表明98.19%的乙酯得率都可以用這個(gè)模型預(yù)測(cè)，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)很準(zhǔn)確。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model

根據(jù)SAS 9.2 預(yù)測(cè)得到的回歸方程各項(xiàng)系數(shù)見(jiàn)表5。

表5 回歸模型的回歸系數(shù)分析Table 5 Regression coefficient of predicted quadratic polynomial model

由表5 可知，X1(加酶量)、X2(反應(yīng)時(shí)間)和X3(醇油摩爾比)3 個(gè)因素的系數(shù)均＜0.05，表明這3個(gè)因素都對(duì)該反應(yīng)有顯著的影響，影響程度為X1(加酶量)＞X2(反應(yīng)時(shí)間)＞X3(醇油摩爾比)。X4(溫度)的系數(shù)為0.064 5 ＞0.05，表明相對(duì)于其它幾個(gè)因素，在選定溫度范圍內(nèi)酶的活性都能保持較高，對(duì)于反應(yīng)影響較小。酶用量對(duì)于反應(yīng)的影響程度最大，且它對(duì)反應(yīng)表現(xiàn)為正向影響。在交叉項(xiàng)中，X1X3的系數(shù)最小，表明它對(duì)反應(yīng)影響程度最大且為正向影響，也就是說(shuō)，同時(shí)增加酶用量和醇油摩爾比乙酯的得率會(huì)提高。在平方項(xiàng)中，的系數(shù)最小，說(shuō)明乙醇加入量對(duì)于反應(yīng)有著重要影響。

圖6 各組交叉因素對(duì)乙酯得率的影響Fig.6 The effect of cross-cutting factors in each group on FAEE yieid

由響應(yīng)面圖6 可知，同時(shí)增加醇油摩爾比和減少酶用量會(huì)使得乙酯得率大大下降，可能的原因是過(guò)量乙醇對(duì)酶有毒害作用，如果同時(shí)減少酶用量會(huì)使得大部分的酶失活，乙酯得率也就下降;同時(shí)升高溫度和增加酶用量也會(huì)使乙酯得率下降，可能原因是過(guò)高的溫度易使酶失活，過(guò)量的酶易聚集，這都會(huì)降低酶的催化活性從而使得率下降;溫度和醇油摩爾比的交叉影響對(duì)于反應(yīng)來(lái)說(shuō)不顯著，但改變其中任何一個(gè)因素都會(huì)使得得率有所下降。

2.3 模型驗(yàn)證

根據(jù)圖6 中的響應(yīng)面可知，該回歸模型具有穩(wěn)定點(diǎn)。通過(guò)回歸模型分析預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為:加酶量6.0%，醇油摩爾比4.0∶1，溫度44.7 ℃，反應(yīng)時(shí)間17.6 h，乙酯得率為94.35%。根據(jù)預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件，結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行了3 次平行實(shí)驗(yàn)，得到乙酯的平均得率為94.86%，與預(yù)測(cè)值極為接近，表明在選定范圍內(nèi)該模型能夠很好地預(yù)測(cè)酶催化微藻油脂乙酯化反應(yīng)，該響應(yīng)面模型有效。

3 結(jié)論

研究了無(wú)溶劑體系中微藻油脂的酶法乙酯化技術(shù)工藝，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 設(shè)計(jì)的響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)，得出酶法催化藻油乙酯化最優(yōu)條件為:固定化Novozym 435 脂肪酶加酶量6.0%，醇油摩爾比4.0∶1，溫度44.7 ℃，反應(yīng)時(shí)間17.6 h，在該條件下生物柴油得率達(dá)94.86%。同時(shí)，較高的乙酯轉(zhuǎn)化率為從藻油提取不飽和脂肪酸奠定了良好技術(shù)基礎(chǔ)。

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