神經(jīng)降壓素類(lèi)似物的固相合成

王小青，李松濤，宮聞婧，尹志峰，王良友

(1.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000;2.承德天創(chuàng)生物制品有限公司，河北 承德 067000)

神經(jīng)降壓素(NT)是1973 年美國(guó)生理學(xué)家Carraway 和Leeman［1］在分離牛的下丘腦P 物質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)的一種能使毛細(xì)血管通透性增加、皮下血管擴(kuò)張以及短暫降低動(dòng)脈血壓的物質(zhì)。NT 由13 個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸序列為pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，具有廣泛的生物學(xué)功能［2-5］。NT 具有開(kāi)發(fā)成為安定藥、鎮(zhèn)痛藥和降壓藥［6-7］的應(yīng)用前景。同時(shí)，NT 具有高活性、作用快速等特點(diǎn)，能迅速降低人或動(dòng)物的血壓，在軍用失能劑開(kāi)發(fā)方面具有一定的潛力。

NT 游離羧基端是受體主要結(jié)合部位，決定其生物活性。在血液循環(huán)和組織中，NT 被作用于羧基端的金屬內(nèi)切肽酶緩慢滅活，主要降解部位是Arg8-Arg9，Pro10-Tyr11及Pro7-Arg8三處肽鍵［8］。NT 作為軍用失能劑開(kāi)發(fā)，需作用迅速，持久，并且不易失活。本文設(shè)計(jì)將神經(jīng)降壓素的Pro7替換成Ser7，可能會(huì)避免被金屬內(nèi)切酶識(shí)別而失去活性，以Fmoc 固相合成策略，合成了神經(jīng)降壓素類(lèi)似物(Neurotensin analogue，NTA)，氨基酸序列pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Ser-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，分子量1 663.1，并優(yōu)化了裂解條件，為進(jìn)一步研究其降壓活性提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Wang Resin(替代度為1.14 mmol/g)，天津南開(kāi)合成科技有限公司;Fmoc 保護(hù)的氨基酸包括Fmoc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-pGlu-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH 均購(gòu)自成都誠(chéng)諾新技術(shù)有限公司;縮合試劑1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)由蘇州中科天馬肽工程中心有限公司提供;醋酸酐、哌啶、三氟乙酸(TFA)、甲醇、二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙醚均為分析純;乙腈，色譜純;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

Agilent Technologies 1200 型高效液相色譜儀;Newstyle 型反相高效制備液相色譜儀;Heal Force 純水機(jī);LGJ-18 型冷凍干燥機(jī);TDL-40B 型高速離心機(jī);Spectrum-752 型紫外分光光度計(jì);AR224CN 型分析天平;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相合成

2.1.1 合成路線 見(jiàn)圖1。

圖1 NTA 的合成路線Fig.1 The synthetic routes of NTA

2.1.2 肽樹(shù)脂的制備 在洗凈并干燥的反應(yīng)柱中，加入0.877 2 g(1 mmol)wang 樹(shù)脂，加DMF 通氮?dú)馊苊?0 min，充分溶脹后抽掉DMF，用DMF 和DCM分別洗滌樹(shù)脂，抽干溶劑。稱(chēng)0. 779 g (2 mmol)Fmoc-Leu-OH、0.324 2 g HOBt(2.4 mmol)與0.024 4 g(0.2 mmol)DMAP 溶于DMF，冰浴并加入0.37 mL(2.4 mmol)DIC 活化5 min，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1.5 h，抽干，分別用DMF 與DCM 洗滌樹(shù)脂，并進(jìn)行替代度檢測(cè)，加入11 mL 的醋酸酐與吡啶(V/V，6 ∶5)混合液封閉14 h。沖洗樹(shù)脂，加甲醇收縮2 次(5 min/次)，減壓干燥至恒重，得干燥樹(shù)脂。按照合成路線，依次偶聯(lián)氨基酸，甲醇收縮樹(shù)脂，抽干并稱(chēng)重得肽樹(shù)脂1.55 g。

2.1.3 裂解與沉淀 置上述肽樹(shù)脂于茄形瓶中，加入裂解液TFA/間甲酚/EDT(95 ∶3 ∶2)16 mL，室溫下反應(yīng)2 h。脫脂棉過(guò)濾，用少許TFA 洗滌樹(shù)脂，將濾液傾入160 mL 無(wú)水冰乙醚中，析出白色固體，0 ℃靜置沉降20 min。4 000 r/min 離心4 min，棄去上清液，重復(fù)5 次，真空干燥至恒重，得(1)粗肽1.13 g。

2.2 粗肽分析

2.2.1 高效液相色譜分析 色譜柱Agela C18 柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:A 水(0. 1%TFA)，B 為乙腈(5% 水，0. 1% TFA)，B 相5% ～95% 梯度洗脫20 min，進(jìn)樣量為5 μL，流速 為0.8 mL/min，檢 測(cè) 波 長(zhǎng)215 nm。粗 肽 純 度 達(dá)91.82%(面積歸一化法)，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 粗肽高效液相分析圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of the crude peptide

2.2.2 質(zhì)譜分析 取適量粗肽進(jìn)行ESI-MS 分析，可知雙電荷離子峰為m/z 832.5［M+2H］2+與理論值832.56 一致，三電荷離子峰m/z 555. 3［M +3H］3+與理論值555.37 一致。分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 ESI-MS 分析圖譜Fig.3 The chromatogram of ESI-MS

由圖3 可知，氨基酸序列中含有2 個(gè)Arg 與1個(gè)Lys，在進(jìn)行ESI-MS 鑒定時(shí)，易失去兩個(gè)到三個(gè)H，從而帶有兩個(gè)到三個(gè)電荷，即［M +2H］2+與［M+3H］3+。

2.3 純化與轉(zhuǎn)鹽

(1)粗肽稱(chēng)重，50%乙腈超聲溶解，0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，經(jīng)制備型RP-HPLC 分離純化，色譜柱Hedera ODS-2(20 mm ×250 mm，10 μm)制備柱。流動(dòng)相:A 為水(0.3% HAc)，B 為乙腈，流速為15 mL/min，B 相22% ～32%梯度洗脫30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。分段收集主峰，合并經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)純度＞98%的組分，減壓濃縮除去乙腈，冷凍干燥得(1)純品0.665 g。分析圖譜見(jiàn)圖4，多肽總收率= 純肽實(shí)際重量/理論量× 100% = 665 mg/1 mmol×1 663.1 g/mol=39.99%。

圖4 NTA 純化后分析圖譜Fig.4 The HPLC chromatogram of NTA

2.4 結(jié)構(gòu)確證

取(1)純品進(jìn)行ESI-MS 分析，可知雙電荷離子峰為m/z 832.5［M+2H］2+與理論值832.56 一致，三電荷離子峰m/z 555. 3［M + 3H］3+與理論值555.37 一致。

2.5 裂解體系的選擇

稱(chēng)取100 mg 縮合后的肽樹(shù)脂，反應(yīng)溫度30 ℃，不同比例的裂解試劑分別反應(yīng)2 h，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 裂解體系對(duì)粗肽收率的影響Table 1 The cleavage reagent affects the yield of crude peptide

由表1 可知，采用方法3 TFA ∶EDT ∶間甲酚(95 ∶4 ∶1)切割試劑的配方，可以取得最好的切割效果。NTA 的Fmoc 保護(hù)氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基主要有tBu、Boc、Pbf 與Trt 四種，TFA 對(duì)tBu、Boc、Pbf 與Trt幾種保護(hù)基的脫除均有較好的捕獲效果，同時(shí)EDT與苯甲硫醚能增強(qiáng)對(duì)tBu 裂解時(shí)產(chǎn)生的碳正離子的捕獲，間甲酚能夠更好的防止切割捕獲不完全造成的粗肽純度降低的問(wèn)題。

2.6 肽樹(shù)脂與裂解試劑比例對(duì)粗肽收率及純度的影響

以TFA∶間甲酚∶EDT 為裂解體系，對(duì)不同肽樹(shù)脂與裂解試劑的比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察料液比對(duì)粗肽收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。肽樹(shù)脂與裂解試劑為1∶10 時(shí)粗肽的收率及純度較好。

表2 料液比對(duì)粗肽收率的影響Table 2 Liquid ratio affects the yield of crude peptide

3 結(jié)論

本文采用Fmoc 固相多肽合成方法，以Fmoc 保護(hù)氨基酸為原料，Wang Resin 為載體，經(jīng)DIC/HOBT縮合，TFA/間甲酚/EDT 裂解體系脫除保護(hù)基，經(jīng)RP-HPLC 純化并轉(zhuǎn)為醋酸鹽。獲取了經(jīng)RP-HPLC分析為單一峰的目的肽，總收率為39.99%。

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