核酸檢測技術(shù)在酶聯(lián)免疫吸附法漏檢HIV和HBV血樣篩查中的應(yīng)用

【摘要】目的：于酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV（人類免疫缺陷病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）血樣篩查中應(yīng)用核酸檢測技術(shù)的效果進(jìn)行研究。方法：對(duì)2018年1月到2020年1月的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行研究，標(biāo)本經(jīng)六混樣兩種試劑做核酸檢測，對(duì)陽性標(biāo)本用兩種試劑拆分做膽管核酸檢測，總結(jié)檢測結(jié)果。結(jié)果：在4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中，經(jīng)核酸檢測技術(shù)篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標(biāo)本。結(jié)論：血液標(biāo)本即便是經(jīng)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時(shí)，仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用核酸檢測技術(shù)可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標(biāo)本，而進(jìn)一步確保用血質(zhì)量、安全。

【關(guān)鍵詞】輸血；人類免疫缺陷病毒；乙型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫吸附法；核酸檢測技術(shù)；應(yīng)用價(jià)值

[中圖分類號(hào)]R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）07-0141-02

輸血是臨床重要的一種治療方式，可及時(shí)補(bǔ)充患者血容量，挽救生命。在輸血中，要嚴(yán)格確保輸血質(zhì)量以及安全，但人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等可經(jīng)血傳播的病毒一直是輸血安全上最受人們關(guān)注的一個(gè)問題[1]。酶聯(lián)免疫吸附法是以往血液常規(guī)篩查的一種手段，可檢測無償獻(xiàn)血者血液中的病毒抗體、病毒抗原，并以此當(dāng)做血液感染與否的指標(biāo)[2]。酶聯(lián)免疫吸附法可明顯降低通過輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn)，但是由于抗體、抗原檢測是標(biāo)志物的間接檢測方法，窗口期較長，并會(huì)受病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素的影響，導(dǎo)致經(jīng)輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn)仍然存在[3]。而核酸檢測技術(shù)是對(duì)病毒核酸直接進(jìn)行檢測，其檢測窗口期明顯縮短，而且在窗口期也能檢測出人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒，同時(shí)還可避免因病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素造成的漏檢，彌補(bǔ)酶聯(lián)免疫吸附法的不足，進(jìn)一步的降低經(jīng)輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn)[4]。本課題主要是探究酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV和HBV血樣篩查中應(yīng)用核酸檢測技術(shù)的效果，請(qǐng)見下文。

1 資料和方法

1.1臨床資料 對(duì)2018年1月到2020年1月的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行研究，采集血液后，在核酸檢測分離膠試管中保存，4 h內(nèi)進(jìn)行離心，3000 r/min，20 min，之后在4℃的環(huán)境下進(jìn)行保存。

1.2方法 （1）試劑和儀器：低溫離心機(jī)，瑞士IVD混樣儀，Cobas AmpliPrep、Cobas TaqMan，Cobsa TaqScree MPX試劑盒，Cobsa TaqScree洗液、Cobsa TaqScree MPX V2對(duì)照試劑盒，Cobsa TaqScree MPX對(duì)照試劑盒。（2）檢測方法：①酶聯(lián)免疫吸附法：標(biāo)本做兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測，加樣器自動(dòng)加樣，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附分析儀對(duì)抗乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體進(jìn)行兩次檢測，按《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》關(guān)于血站部分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行判定當(dāng)標(biāo)本的酶聯(lián)免疫吸附法檢測是陰性，而核酸檢測是陽性時(shí)，重新取樣做酶聯(lián)免疫吸附法檢測。②核酸檢測技術(shù)篩查：在生物安全柜中，打開標(biāo)本蓋，在樣本架上放置，混樣儀自動(dòng)開展六混樣處理，平行混合兩份。一份是經(jīng)全自動(dòng)血液病毒核酸檢測儀+MPX試劑盒開展核酸檢測，對(duì)人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒進(jìn)行檢測。另外一份經(jīng)另外一臺(tái)檢測儀+MPX V2試劑盒開展核酸檢測，其檢測內(nèi)容同上一份一致。當(dāng)六混樣試管陽性，就做拆分單管核酸檢測。六混樣初篩結(jié)果是兩種試劑均判定是陽性，而拆分檢測結(jié)果也是陽性，則樣本核酸檢測就是陽性。

2 結(jié)果

2.1總結(jié)窗口期酶聯(lián)免疫吸附法的兩次檢測結(jié)果 自動(dòng)加樣后（加樣器），在兩臺(tái)全自動(dòng)酶免分析儀上使用兩種不同廠家試劑進(jìn)行兩次乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢測，光密度值分別是0.002、0.047，而判定是陰性。核酸檢測發(fā)現(xiàn)該標(biāo)本是人類免疫缺陷病毒陽性，從血袋再次取標(biāo)本同時(shí)使用兩種試劑進(jìn)行檢測，光密度值分別是0.006、0.040，再次判定酶聯(lián)免疫吸附檢測結(jié)果仍呈陰性。

2.2總結(jié)漏檢人類免疫缺陷病毒標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果Cobas TaqScreen MPX的六混樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上，熒光探針在第19.2個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出，但內(nèi)置控沒有擴(kuò)增出來，而該批次的其他陰性樣本檢測中均擴(kuò)增出內(nèi)置控，推測該樣本的病毒載量濃度過高，使反應(yīng)被抑制。Cobas TaqScreen MPX第二代制劑的六混樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上，熒光探針在第21.8個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出，該試劑選擇多熒光探針技術(shù)，CH4是內(nèi)置控、CH1是人類免疫缺陷病毒，同內(nèi)置控多熒光探針技術(shù)相比，六混樣檢測的靈敏度較很好，且在高濃度抑制擴(kuò)增上內(nèi)置控也有改進(jìn)。

2.3總結(jié)漏檢人類免疫缺陷病毒標(biāo)本的核酸檢測拆分單檢結(jié)果 單管核酸檢測的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上，熒光探針在第16.4個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出，說明濃度更高，但仍未擴(kuò)增出內(nèi)置控，從而更有理由推斷是其病毒載量濃度過高，使反應(yīng)被抑制。所以，經(jīng)陰性血漿把標(biāo)本稀釋400倍，之后再進(jìn)行核酸檢測，Cobas TaqScreen MPX試劑復(fù)孔進(jìn)行單管核酸檢測，熒光探針在第24.7個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出，在第30.3個(gè)循環(huán)時(shí)內(nèi)置控在擴(kuò)增曲線開始抬頭，樣本稀釋后不在抑制內(nèi)置控?cái)U(kuò)增，但稀釋后樣本仍遠(yuǎn)提前于內(nèi)置控?cái)U(kuò)增。在第19個(gè)循環(huán)時(shí)CH1探針就有靶標(biāo)核酸片段檢出，判定樣本人類免疫缺陷病毒陽性。

2.4總結(jié)酶聯(lián)免疫吸附法漏檢乙型肝炎病毒的情況在4000份血液標(biāo)本中，核酸檢測工檢出4份乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本，檢出率是0.10%。

3 討論

在本課題的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中，經(jīng)核酸檢測技術(shù)篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標(biāo)本。從而得知：即便是經(jīng)過兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測，無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本仍存在人類免疫缺陷病毒感染、乙型肝炎病毒感染的情況，影響用血安全[5]。對(duì)于核酸技術(shù)來說，盡管可篩查出酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)于人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的漏檢標(biāo)本，但是不能徹底的消除乙型肝炎病毒窗口期，不過能夠把經(jīng)輸血傳播乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)降到最低[6]。

目前在全世界范圍內(nèi)，抗體檢測相關(guān)試劑已發(fā)展到第四代，對(duì)于前三代試劑來說，主要是對(duì)兩種抗體進(jìn)行檢測，而第四代試劑能夠同時(shí)檢測免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原，同時(shí)把窗口期縮短到三周[7]。在本課題中，是對(duì)血液標(biāo)本使用兩種不同廠家的第四代試劑進(jìn)行兩次檢測，經(jīng)核酸檢測技術(shù)對(duì)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測均呈陰性的樣本再次進(jìn)行篩查，結(jié)果表示篩查出了人類免疫缺陷病毒陽性、乙型肝炎病毒陽性的標(biāo)本。說明：在臨床用血的酶聯(lián)免疫吸附法檢測中，仍存在一定安全隱患，需開展核酸檢測來確保臨床用血安全[8]。

在感染者血液標(biāo)本中，最早被檢測出來的是病毒核酸，且呈一過性的高水平，之后水平有所下降。于本課題中，在第19個(gè)循環(huán)時(shí)CH1探針就有靶標(biāo)核酸片段檢出，明顯提前于在第30.3個(gè)循環(huán)時(shí)內(nèi)置控在擴(kuò)增曲線開始抬頭，所以推斷同內(nèi)置控病毒載量水平相比，其水平是相當(dāng)高的，但經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法并未檢測出免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原等，說明該樣本很可能是處于最早期感染階段，病毒核酸一過性高水平，剛好P24抗原水平下降但抗體未升高或者P24抗原未出現(xiàn)而導(dǎo)致漏檢[9]。同第四代酶聯(lián)免疫吸附法試劑比較來說，核酸檢測技術(shù)把窗口期縮短了五天，證實(shí)縮短窗口期可確保輸血安全[10]。

總之，血液標(biāo)本即便是經(jīng)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時(shí)，仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用核酸檢測技術(shù)可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標(biāo)本，而進(jìn)一步確保用血質(zhì)量、安全。

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作者簡介：崔永利（1977.01-）， 男， 漢族，山東淄博人，淄博市中心血站，主管技師。E_mail：CYL0533@126.com