草酸誘導紫花苜蓿對霜霉病的抗性

李克梅，張芯偽，王麗麗，先米西努爾·肉孜

(新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊830052)

苜蓿(Medicago sativa)屬豆科苜蓿屬多年生草本植物，由于其品質優(yōu)良，適口性好，因此作為主要牧草被廣泛種植［1］。苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌(Peronospora aestivalis)侵染引起的世界性病害，在我國發(fā)生普遍［2-3］，現已成為限制我國苜蓿生產的主要病害之一［4］。由于目前生產上對苜蓿霜霉病的防治存在缺乏抗病品種、農業(yè)防治周期長見效慢、化學防治的安全性堪憂等問題，因此，探索更為安全、高效的苜蓿霜霉病防治措施是當前苜蓿生產中急需解決的問題之一。植物誘導抗病性因其不污染環(huán)境、抗病周期長等特點，逐漸成為防治植物病害研究的熱點，被當作是發(fā)掘植物內在抗性機制的一種全新的病害防治方法和措施［5-6］，王海華和康健［7］報道了國外已有將誘導因子應用于大田作物的嘗試，并取得了良好的防治效果。國內針對植物誘導抗病性也開展了一系列研究，證明茉莉酸甲酯能誘導水稻(Oryza sativa)幼苗對白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和水稻苗期細菌性條斑病(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的抗性，并提高水稻相關防御酶的活性［8-9］;水楊酸處理可以改變人參(Panax ginseng)根部相關防御酶的活性，從而提高對人參銹腐病(Cylindrocarpon destructans)的抗性［10］;水楊酸對番木瓜環(huán)斑病毒病(Papaya Ringspot Virus，PRV)有很好的誘導防病效果［11］。上述研究成果也為苜蓿病害的防治打開了新思路［12］，故針對苜蓿霜霉病進行誘導抗性研究，對探索苜蓿病害防治新技術具有重要意義。目前，利用誘導抗病性防治植物病害的研究對象主要包括糧食、油料、瓜果、煙草(Nicotiana tabacum)等［13］作物，用在牧草病害防治方面的報道很少。

草酸(Oxalic Acid，OA)是一種有效的化學誘抗劑，它能顯著提高植物對不同病菌的系統(tǒng)抗病性［14-18］，但草酸誘導苜?？顾共〉难芯可形匆妶蟮?。本研究用苜蓿霜霉病菌接種預先經草酸處理過的苜蓿幼苗，測定草酸誘導苜蓿抗霜霉病的效果以及經草酸誘導后苜蓿幼苗葉片中過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化，旨在確定草酸誘導苜?？顾共∽饔玫陌踩褂昧亢统中?，為利用草酸防治苜蓿霜霉病提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植株及菌種 供試苜蓿品種為“新疆大葉”，由新疆農業(yè)大學草環(huán)學院育種基地提供。

供試苜蓿霜霉菌，采自田間自然發(fā)病植株，在20 ℃培養(yǎng)箱內水培備用［19］。

1.1.2 供試藥劑及濃度 草酸為天津市福晨化學試劑廠生產，品質為分析純。草酸用蒸餾水溶解，藥液經細菌過濾器過濾。在前期預試驗過程中，草酸濃度分別為1 和5 mmol·L－1時，誘導酶活性變化差異不顯著，草酸濃度為50 mmol·L－1時，苜蓿苗葉片發(fā)黃，顯示輕度藥害癥狀，故將其稀釋至供試濃度分別為10、20、30、40 mmol·L－1備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 苜蓿苗培養(yǎng) 參照孫濤等［4］的方法培養(yǎng)苜蓿苗，待真葉長至十葉期時接種。

1.2.2 草酸對苜蓿幼苗誘導抗病性測定 選擇十葉期的苜蓿健康幼苗，配制不同濃度10、20、30、40 mmol·L－1的草酸溶液噴霧處理，以清水作對照。共噴藥兩次，間隔3 d，第2 次噴藥3 d 后接種，每個處理重復3 次。苜蓿霜霉病菌的制備和接種方法參照李克梅等［19］的方法進行。孢子囊溶液配好后立即施用，均勻噴灑到健康苜蓿葉片的正反兩面，先保濕暗培養(yǎng)24 h，然后在溫度18 ～20 ℃、相對濕度60% ～80%、光照強度1 500 lx、日光照8 ～10 h 人工生長箱中培養(yǎng)。一周后采集所有葉片調查發(fā)病情況，根據苜蓿霜霉病的分級標準，統(tǒng)計病葉數，記錄病葉癥狀反應級別，計算病情指數和誘抗效果。

1.2.3 苜蓿霜霉病嚴重度分級標準 0 級:無病斑;1 級:病斑面積小于葉片總面積的1/3;2 級:病斑面積大于葉片總面積的1/3，但小于2/3;3 級:病斑面積大于葉片總面積的2/3［20］。

1.2.4 苜蓿葉片內防御酶活性的測定 選用健康的苜蓿種子，消毒催芽播種于花盆內(每盆15 株)。方法同1.2.1。待苜蓿幼苗長到十葉期時，用草酸對苜蓿幼苗誘導抗病性測定試驗中確定濃度的草酸溶液噴霧處理苜蓿植株，以葉片上均勻布滿微小霧點為宜，以清水為對照。分別在經草酸溶液噴霧處理后的1、3、5、7 和9 d 測定苜蓿葉片中POD、PAL、SOD 的活性。每處理重復3 次。

POD 活性測定采用Ye 等［21］的方法;SOD 和PAL 活性測定采用湯章城［22］的方法。各樣品測定3 次，3 個重復。以上方法均略有改動。

1.3 數據分析

所有試驗數據均采用Excel 和DPS 7.05 軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度草酸對苜蓿幼苗抗霜霉病的誘抗效果

不同濃度草酸溶液處理的苜蓿植株與對照相比抗病性明顯增強，在10 ～40 mmol·L－1草酸溶液誘導下，誘抗效果呈上升趨勢(表1)。處理濃度為40 mmol·L－1時，誘抗效果可達50.8%。草酸濃度10、20、30 mmol·L－1之間誘抗效果均差異顯著(P ＜0.05)，30 和40 mmol·L－1處理間的誘抗效果無顯著差異(P ＞0.05)。當草酸濃度為40 mmol·L－1時，盡管其防治效果最好，但與30 mmol·L－1處理間無顯著差異，從實用和經濟角度考慮，選用30 mmol·L－1為誘導處理適宜濃度。因此，在苜蓿葉片防御酶活性測定中以30 mmol·L－1為處理濃度。

表1 草酸對苜蓿霜霉病的誘導抗病效果Table 1 Effects of alfalfa resistance against downy mildew induced by oxalic acid

2.2 草酸處理對苜蓿葉片防御酶活性的影響

2.2.1 草酸對過氧化物酶(POD)活性的影響 經30 mmol·L－1草酸溶液誘導處理后1 ～9 d 的苜蓿葉片的POD 活性均有提高，其活性呈先升后降的趨勢，草酸誘導處理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿葉片組織內POD 活性分別為對照的1.04、1.26、1.59、1.18和1.27 倍。從誘導后1 d 開始，POD 活性持續(xù)升高，并 于 誘 導 處 理 后 5 d 達 到 最 大(8. 22 U·g－1·min－1)，而此時對照的POD 活性為5.16 U·g－1·min－1。之后酶活性開始下降，至誘導處理后9 d 時降至6.05 U·g－1·min－1，但仍顯著高于對照(P ＜0.05)(圖1)。

圖1 草酸對苜蓿葉片POD 酶活性影響Fig.1 Effects of oxalic acid on alfalfa POD activity

2.2.2 草酸對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響苜蓿葉片中PAL 活性在30 mmol·L－1草酸溶液誘導處理后1 ～9 d 均高于對照，分別為對照的1.05、1.08、1.39、1.31 和1.30 倍，且從3 d 開始均與對照差異顯著(P ＜0.05)，至5 d 時達到最大值(5.64 U·g－1·h－1)，而此時對照的PAL 活性為4.06 U·g－1·h－1。之后PAL 活性開始下降，但7 d和9 d 時PAL 活性依然能分別達到4.91 和4.67 U·g－1·h－1，說明草酸誘導可使PAL 活性增強，且能持續(xù)到9 d(圖2)。

2.2.3 草酸對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響經30 mmol·L－1草酸溶液誘導處理不同時間苜蓿葉片中SOD 活性均顯著高于對照(P ＜0.05)，誘導處理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿葉片組織內SOD 活性分別為對照的1.10、1.56、1.29、1.37 和1.40 倍。誘導后3 d，苜蓿葉片組織內SOD 活性達到最大(642.47 U·g－1)，而此時對照的SOD 活性為412.15 U·g－1，處理5、7 和9 d 后的苜蓿葉片SOD活性略有下降，但均顯著高于對照(P ＜0.05)(圖3)。

圖2 草酸對苜蓿葉片PAL 酶活性影響Fig.2 Effects of oxalic acid on alfalfa PAL activity

圖3 草酸對苜蓿葉片SOD 酶活性影響Fig.3 Effects of oxalic acid on alfalfa SOD activity

3 討論與結論

本試驗結果表明，10 ～40 mmol·L－1草酸溶液均可降低苜蓿幼苗霜霉病的病情指數，且隨草酸濃度增加誘抗效果呈上升趨勢，但草酸濃度為30和40 mmol·L－1時，誘導防效無顯著差異(P ＞0.05)，這說明誘導劑在一定濃度范圍內可能與植物獲得的誘導抗性程度呈正相關，但當誘導劑達到一定濃度后就可充分誘導植株體內相關防御機制的運轉，之后并不隨著誘導劑濃度增大而使植株誘導抗性繼續(xù)增強。在植物的誘導抗病過程中伴隨著一系列物質的代謝，其中關鍵因子就是催化這些反應的酶［12］。本試驗中使用誘導劑草酸處理苜蓿幼苗后，葉片組織中POD、PAL、SOD 活性比清水處理均有不同程度的提高，表明外源草酸可提高苜蓿葉片相關防御酶活性，草酸誘導苜蓿對霜霉病抗性獲得可能與相關防御酶活性的提高有關，此研究結果與在黃瓜(Cucumis sativus)［23］、油菜(Brassica campestris)［24］上的研究結果基本一致。另外，隨著30 mmol·L－1草酸溶液處理時間的推移，3 種酶活性均高于清水對照，但總體呈現先升后降的趨勢，可能是外源草酸激活了與POD、PAL、SOD 表達有關的信號分子，使其表達量上升到一定峰值，但隨后可能隨著草酸被消耗，相應的酶活性又逐漸降低，直至處理后9 d，活性仍然高于清水對照，說明草酸誘導的持效性大于9 d。

誘導抗性技術是植物病害防治的一條新途徑，特別是對生產上缺乏抗病品種和有效的化學防治藥劑或者不適合使用化學農藥的植物病害尤為重要。在苜蓿病害防治中，由于化學農藥的使用不利于綠色奶業(yè)的發(fā)展，故誘導抗性的研究可為尋找苜蓿病害安全防控新技術提供依據。草酸是一種有效的非生物誘導劑，應用外源草酸可顯著降低林木炭疽病、西瓜花葉病毒病、油菜菌核病、黃瓜炭疽病、黃瓜霜霉病等病害的病情指數，提高植物對病害的抗性［23］。本研究結果證明，外源草酸能顯著降低苜蓿霜霉病的病情指數，提高苜蓿對霜霉病的抗性，且抗性持效期至少在9 d。

本試驗只針對苜蓿的單個病害進行了單一誘導劑誘導抗病，對于同一種誘導劑能否對苜蓿的其他病害產生誘導作用以及不同誘導劑組合使用效果如何等方面尚未涉及，有待進一步研究。

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