蒺藜苜蓿EMS 誘變突變體庫的構(gòu)建及突變體表型的分析

陳天龍，王彥榮，王 宇，張吉宇，劉志鵬

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020)

隨 著 擬 南 芥(Arabidopsis thaliana)［1］和 水 稻(Oryza sativa)［2］等模式植物基因組測序的完成，植物的功能基因組研究進展迅速。目前已經(jīng)發(fā)展了多種分析鑒定基因功能的方法，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因沉默技術(shù)、基因敲除技術(shù)等，其中最為直接有效的方法是構(gòu)建飽和的基因突變體庫，利用突變體和突變基因之間直接的因果關(guān)系分析鑒定基因功能［3-4］。擬南芥、水稻等模式植物的功能基因組研究已充分表明，該方法在闡明基因功能方面發(fā)揮著重要作用。

化學(xué)誘變是構(gòu)建突變體庫的重要方法之一［5］。目前，使用較多的化學(xué)誘變劑是甲基磺酸乙酯(EMS)。與其他的理化誘變劑相比，EMS 可直接對種子進行處理，無需組織培養(yǎng)的過程，誘變后用轉(zhuǎn)基因方法獲得感興趣的突變體更省時、省力［6］;另外，EMS 具有誘變率高、范圍廣、誘變類型豐富且得到的突變體多為點突變等特點，因而被廣泛用于構(gòu)建突變體庫［7-12］。目前，利用EMS 誘變已構(gòu)建了擬南芥［13］、玉 米(Zea mays)［14］、大 麥(Hordeum vulgare)［15］、小麥(Triticum aestivum)［16］等模式植物的突變體庫并在基因的功能分析上進行了深入研究。Slade 等［16］利用EMS 誘變分別構(gòu)建了普通小麥和硬粒小麥的突變體庫，同時以小麥顆粒淀粉合成酶Ⅰ基因片段為引物，篩選出了多個突變體。Chiu等［17］用EMS 處理擬南芥種子，獲得了擬南芥突變體庫，并深入分析了TORNADO2 基因在花器官發(fā)育中的作用。于秀普等［18］利用EMS 和平陽霉素共同處理大豆(Glycine max)種子，對變異株進行連續(xù)選擇，選育出具多種優(yōu)良性狀的冀豆8 號，已經(jīng)大面積推廣種植。根據(jù)Maluszynski 等［19］的報道，得益于誘變技術(shù)的應(yīng)用，全世界研究人員已經(jīng)從154 種植物中培育出了1 737 個品種，并在生產(chǎn)實踐中產(chǎn)生了巨大的價值。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作為豆科模式植物，耐干旱、耐冷熱、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，又能改良土壤，因而被廣泛栽培利用［20］。與其他豆科植物相比，蒺藜苜蓿具有遺傳轉(zhuǎn)化率高、生長周期短、基因組較小、自花授粉等優(yōu)點，因而在植物分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究中備受關(guān)注［20］。蒺藜苜蓿和大部分豆科植物有遺傳上的相似性，如紫花苜蓿(M. sativa)、大豆、豌豆(Pisum sativum)和三葉草(Trifolium sp.)等，從蒺藜苜蓿獲得的信息可以用于其他豆科植物，因此創(chuàng)建蒺藜苜蓿突變體庫，不僅可以促進豆科作物和豆科牧草的遺傳學(xué)和基因組學(xué)的研究，而且在發(fā)掘豆科植物的遺傳資源，促進豆科作物和豆科牧草育種方面具有重要的意義［21］。在過去十多年中，在蒺藜苜?；蚪M測序和研究上已經(jīng)取得了很多的成果，然而有關(guān)蒺藜苜蓿EMS 突變庫建立的報道甚少，雖然國外已經(jīng)構(gòu)建了一些EMS 突變體庫［22-23］，但還遠沒有達到飽和狀態(tài)。本研究以0.15% EMS誘導(dǎo)蒺藜苜蓿A17 種子，以期獲取M2代突變植株，初步構(gòu)建蒺藜苜蓿的突變體庫，旨在為蒺藜苜蓿分子遺傳學(xué)研究、基因功能分析和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

試驗用蒺藜苜蓿A17 種子由美國Samuel Roberts Noble 基金會提供。誘變劑EMS 購自中國綠園公司。

1.2 誘變處理

首先精選A17 成熟種子，用濃硫酸處理5 min打破硬實，并用蒸餾水沖洗5 次以上。接著將種子置于4 ℃冰箱磷酸緩沖液(100 mmol·L-1，pH 7.0)中預(yù)浸12 h。然后用磷酸緩沖液配制0.15%(V/V)的EMS 溶液，室溫黑暗條件下處理種子15 h，期間翻轉(zhuǎn)輕搖。最后用蒸餾水沖洗EMS 處理種子3 次，每次30 min，以去除種子上殘留的EMS。

1.3 M 1 代試驗

2012 年4 月將處理后的種子播種于花盆，溫室適宜條件下生長出苗后記為M1代植株。植株生長期間，統(tǒng)計成活總株數(shù)以及突變株數(shù)，同時以野生型為對照觀察M1代植株突變性狀的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，分類統(tǒng)計鑒定，掛牌作標記并拍照，10 月收獲M1代種子保存。

1.4 M 2 代試驗

2012 年11 月從M1代收獲的種子中選擇200份單株種子，每個單株為一個株系，每個株系種植10 株，并將M1代其余種子存入種質(zhì)資源庫。M2代出苗后仔細觀察蒺藜苜蓿生長各個時期的突變情況，并將野生型和誘變后的材料作為對照，記錄突變表型。2013 年4 月按單株收獲后存放(M2代種子)。

突變株頻率=突變株數(shù)/成活總株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 M 1 代表型性狀突變篩選

經(jīng)EMS 誘變處理后的A17 種子播種出苗后，在全生育期內(nèi)長勢與對照比較差異明顯。具體表現(xiàn)為種子發(fā)芽時間延遲，相比野生型出苗期推遲了3 d，發(fā)芽率和成苗率都明顯下降，分別為58.0%和43.5%，突變植株即使成活，苗期也表現(xiàn)出早期生長緩慢、成株后生活力弱等特點。部分突變植株的葉片色澤、葉片形狀發(fā)生變異，成株后可觀察到部分株高、育性、成熟期突變等變異類型，并且有些突變體表現(xiàn)出嵌合體的特征。整個M1代共發(fā)現(xiàn)1 982 株在葉色、葉形、育性等性狀上有明顯表型突變的植株，突變率為16.52%。然而，田間調(diào)查顯示M1多數(shù)表型變異無法遺傳給M2代，即這些表型的變化在M2代可以得到恢復(fù)。

2.2 M 2 代突變表型的篩選

對M2代200 個株系的葉色、葉型、株型、開花期等主要農(nóng)藝性狀進行了調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果表明EMS誘變的蒺藜苜蓿A17 M2代群體的各性狀均發(fā)現(xiàn)了突變株(表1)。

表1 M 2 代植株突變表型性狀統(tǒng)計Table 1 Statistics of the characters of mutant phenotype observed in M 2 generation plant

圖1 觀察到的M 1 代植株代表性突變表型Fig.1 Representative mutant phenotypes observed in M 1 generation plant

2.2.1 葉色、葉型性狀突變 統(tǒng)計結(jié)果表明，M2代群體中共觀察到177 株葉片突變的植株，其中葉色變異包括6 種類型，分別表現(xiàn)為葉斑突變(圖1d)、葉深綠、雜色葉(圖1c)、葉紅紫、葉片黃萎以及白化苗，突變率為5.38%;葉型變異包括皺葉(圖1f)、窄葉、卷曲和多葉(圖1b)，突變率為3.12%。其中白化株單株的產(chǎn)量少、結(jié)實率低，并且大部分在苗期死亡;幼苗期黃化株的成活率也相對較低，共獲得45株，能夠成活的白化株和黃化株隨著植株的生長葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，生長后期突變表型逐漸消失;葉片褶皺突變體的葉片表面表現(xiàn)出凹凸不平或皺褶，共計6株;葉片深綠的植株共3 株，其葉片薄而葉色深，株型大且結(jié)莢率高;雜色葉植株基部葉片均在生長后期衰老較慢，株型也較野生型矮且小;葉片卷曲植株共計16 株，相比于對照野生型植株衰老較早;多葉性狀植株9 株，突變率為0.43%。由此可見，葉片卷曲和雜色葉突變性狀在葉片突變類型中頻率較高，突變頻率最高的為葉片黃萎和窄葉，深綠色葉片及葉片褶皺的突變率最低。利用這些葉性狀突變體可以進行苜蓿葉片的光合作用機理以及光合形態(tài)建成的研究。

2.2.2 株型性狀突變 A17 成熟期出現(xiàn)的植株突變類型包括高稈、矮化、匍匐、半匍匐、多分枝和少分枝(表1)。其中株高大于110 cm 的高稈突變株(對照平均73 cm)共18 株，其特點為分枝多、植株長勢強;株高40 cm 以下的矮稈共37 株，其植株矮小且長勢弱;分枝數(shù)13 個以上的多分枝類型(野生型為8 個)共62 株，其植株高且種子產(chǎn)量多;匍匐型和半匍匐型植株分別為22 株和14 株。綜上所述，多分枝植株的突變頻率為2.97%，是株型性狀的突變中突變頻率最高的，而半匍匐最低，僅為0.67%。這些豐富的突變材料對構(gòu)建性狀優(yōu)良的蒺藜苜蓿理想株型有一定的幫助。

2.2.3 開花期性狀突變 經(jīng)EMS 誘變后，A17 開花期受到明顯影響。M2代中共發(fā)現(xiàn)12 個早花植株(較野生型提前13 d 以上)和9 個晚花植株(較野生型推遲15 d 以上)，突變頻率分別為0. 58% 和0.43%。

2.3 EMS 誘導(dǎo)蒺藜苜蓿突變的變異效應(yīng)

觀察發(fā)現(xiàn)，突變材料在不同的生育時期表現(xiàn)出不同的突變類型，突變類型可大致分為3 類:多數(shù)株系內(nèi)的突變植株中出現(xiàn)2 株或2 株以上具有相同的突變類型;有些株系出現(xiàn)多重突變體，即同一株系出現(xiàn)2 種或3 種不同類型突變性狀;部分株系只發(fā)現(xiàn)一種突變類型的植株。相比較而言，Ml代突變頻率最高的為雜色葉類型，達到5.97%，遲花的突變頻率最低，僅為1.02%，M2代突變頻率最高的為多分枝，突變頻率為2.97%，最低的為深綠色葉片，為0.14%。

EMS 誘變可以引起大量功能基因發(fā)生點突變，從而造成不同基因的等位變異，對這些等位變異與相應(yīng)性狀間的關(guān)系進行深入調(diào)查和分析，將有助于進一步清楚基因的功能。另外，根據(jù)人們的生產(chǎn)需要進行農(nóng)藝性狀比較，可篩選出優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的等位變異體。EMS 這類化學(xué)誘變對農(nóng)藝性狀的誘變多數(shù)為不良突變，優(yōu)良突變相對較少。因此，需處理大量的待誘變材料，以期獲得較多的優(yōu)良突變。本試驗獲得了少數(shù)重要農(nóng)藝性狀優(yōu)于野生型的突變植株，如早花、多分枝和株高突變體等材料。一方面，這些優(yōu)良的農(nóng)藝性狀是利用化學(xué)誘變手段得到的，因而可以進一步深入研究控制這些優(yōu)良性狀的新基因或新的等位變異;另一方面，由于蒺藜苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草，因此可通過連續(xù)回交等傳統(tǒng)育種技術(shù)，將來自該突變體庫的部分優(yōu)良性狀突變體作為育種親本，在育種上得到應(yīng)用。

經(jīng)過篩選和整理共獲得葉色性狀、葉型性狀、株型性狀、開花期四大類性狀的突變體共388 份，初步建立突變體庫。某些葉片斑點、植株黃化和失綠表型的植株通常情況下不能正常繁殖，是由于其作為純合體存活能力差，此類突變體的種子可以在雜合狀態(tài)下進行單株種子的保存，解決了此類植株由于自身不能正常繁殖而導(dǎo)致種子不能保存的問題。對于一些突變頻率極低、成熟期很晚的突變體或由于生理和環(huán)境原因不能正常繁殖的突變體，可在M2代中通過株系準確找到，為以后研究突變體之間的親緣關(guān)系提供幫助。

3 討論與結(jié)論

牧草育種的最終目的是能夠培育出產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)的品種，但是在育種工作中由于集中利用相同的種質(zhì)資源，導(dǎo)致品種對環(huán)境的適應(yīng)性降低，成為限制苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)提高的瓶頸。轉(zhuǎn)變這種現(xiàn)狀的有效和可行的途徑之一就是利用誘變育種和分子育種相結(jié)合的方法，即通過理化誘變產(chǎn)生突變體，再經(jīng)多代觀察和鑒定，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新種質(zhì)資源。近年來，利用化學(xué)誘變構(gòu)建突變體庫的手段已成為創(chuàng)造新型種質(zhì)資源的一個重要內(nèi)容［24-25］，并且相對比較成熟。其中，通過EMS 誘變方法培育優(yōu)良種質(zhì)的研究更是獲得了很大的成就。劉治先［26］利用EMS 誘變玉米獲得了多個高油酸和高蛋白的突變體，為玉米育種提供了優(yōu)質(zhì)的材料。張鳳啟等［27］利用EMS誘變甘藍型油菜(Brassica napus)，獲得了大量的形態(tài)和品質(zhì)性狀的突變體。但是該技術(shù)還主要集中運用在對農(nóng)作物突變體庫構(gòu)建上，而運用牧草及飼料作物構(gòu)建突變體庫的研究尚處于起步階段。本研究以蒺藜苜蓿A17 為試驗材料，采用EMS 化學(xué)誘變的方法，研究了EMS 對蒺藜苜蓿生長情況的影響以及突變植株農(nóng)藝性狀的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，初步構(gòu)建了蒺藜苜蓿EMS 誘變的突變體庫。

植物各組織和器官經(jīng)誘變處理后均可能發(fā)生表型的突變，但各種表型的突變頻率不同。Tadege等［23］用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入方法誘變蒺藜苜蓿，發(fā)現(xiàn)M2代群體中突變類型最多的為株型性狀，其次為葉色性狀。本試驗用EMS 誘變處理蒺藜苜蓿A17 種子，發(fā)現(xiàn)在M2代中突變類型最豐富的是株型性狀和葉色性狀，而開花期突變頻率最低，僅有21 株，此結(jié)果與Tadege 等［23］的研究結(jié)果相似。這種現(xiàn)象可能是由于不同性狀的遺傳體系造成的，如葉型、葉色、株型性狀等受到多基因的控制［28-31］，多個基因中的少數(shù)基因突變都能造成性狀表型的改變，進而提高突變的頻率。而其他一些性狀突變頻率較低，是因為在少數(shù)關(guān)鍵的基因上發(fā)生點突變，最后產(chǎn)生表型變異。

有報道稱，EMS 誘變最佳劑量與植物基因組大小呈正相關(guān)，即植物基因組越大誘變所需要的劑量越大［32］。然而在比較了擬南芥、小麥、玉米、大豆等不同植物成功構(gòu)建突變體庫中使用的最佳劑量后發(fā)現(xiàn)，這個假設(shè)是不完全正確的。實際上，EMS 誘變最佳劑量受多個因素影響，如誘變材料自身的性質(zhì)、誘變材料的抗逆性等。其中種子的保護程度是一個非常重要的因素。水稻和小麥的種子都有較厚的外殼保護，即水分滲透所需的時間較長，所以誘變所需的劑量可能就相對較高，而擬南芥、油菜等種皮較薄，幾乎無法阻止水分的滲透，所以誘變所需的劑量可能就相對較低。本試驗所用的EMS 誘變蒺藜苜蓿的半致死劑量為0.15%，相比EMS 誘變大多數(shù)植物的半致死劑量要低。

EMS 誘變后產(chǎn)生的突變頻率高。EMS 誘發(fā)誘變的甘藍型油菜的突變密度為1/41.5 kb［33］、擬南芥為l/170 kb［34］、六倍體小麥為1/25 kb［35］。EMS誘變的效果雖然是隨機誘變，但是只要對誘變后的突變植株根據(jù)需要定向選擇，就可得到有生產(chǎn)價值的突變材料［36］，因而EMS 是最普遍而且高效的誘變劑。本試驗通過EMS 誘變蒺藜苜蓿A17 也獲得了一些早花、多分枝、株高高等突變體，在后續(xù)育種試驗中，可以有目的地針對某個優(yōu)良的性狀，如多分枝和高稈突變體進行多代追蹤，并結(jié)合傳統(tǒng)的育種技術(shù)，從而選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的育種材料。

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