5 株根瘤菌接種紫花苜蓿的效果

石茂玲，鄧 波，劉忠寬，劉 靜，史經(jīng)昂

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京100193;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北 石家莊050051)

土壤鹽堿化嚴(yán)重威脅著世界灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展。我國有廣闊鹽漬土地，其中黃淮海平原是以氯化鈉為主的典型濱海鹽漬區(qū)，土壤鹽堿化面積大，土壤表層的含鹽量最高達(dá)到3.0%。滄州地區(qū)具有大面積的中低產(chǎn)田和鹽堿荒地需要改良，僅東部就有旱(鹽)堿地20 萬hm2以上［1］。

根瘤菌是一類在土壤中有廣泛分布的可以與豆科植物共生固氮的革蘭氏陰性細(xì)菌。苜蓿－根瘤菌的共生固氮可以提高苜蓿產(chǎn)量，改善品質(zhì)。根瘤菌與豆科植物的有效共生受到共生體雙方本質(zhì)及環(huán)境的影響和控制［2］。研究表明，根瘤菌劑接種存在一些問題，如土壤中生存競爭性能不如土著根瘤菌，菌劑施用廣譜性能不佳，菌劑對特定品種的豆科植物的專一性，菌劑施用的地域和環(huán)境差異［3］。為了獲得最佳的增產(chǎn)效果，根瘤菌選種時需針對種植的生態(tài)環(huán)境及寄主植物兩方面因素選擇最佳匹配的根瘤菌［4-6］。以往的大多研究缺乏鹽堿土壤中苜蓿―根瘤菌共生匹配性的田間試驗研究。此外，為了獲得穩(wěn)定的接種效果，還開展了接種方式對豆科牧草產(chǎn)量與固氮效果影響的研究，表明在不同的地區(qū)和生產(chǎn)模式下選擇不同的接種方式才能獲得穩(wěn)定的效果［7］。本研究以5株耐鹽快生型苜蓿中華根瘤菌為材料，分別采用包衣接種和液體菌劑拌種方式對“中苜1 號”苜蓿(Medicago sativa cv. Zhongmu No.1)進(jìn)行接種，于濱海鹽堿地上開展田間試驗，篩選適合濱海鹽堿土壤與“中苜1 號”苜蓿的高效共生根瘤菌及其最佳接種方式，為根瘤菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在河北省南大港國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系滄州綜合試驗地內(nèi)進(jìn)行。位于滄州市東北部，38°23'35″― 38°33'44″ N，117°18'15″― 117°38'17″E。試驗地土壤理化性質(zhì)如表1 所示。

表1 試驗地土壤理化性質(zhì)Table 1 The properties of the soil in the experimental field

1.2 供試材料

選用在黃淮海平原、渤海灣一帶廣泛種植的耐鹽紫花苜蓿品種“中苜1 號”，種子由中國農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。所用菌株為耐鹽快生型苜蓿中華根瘤菌，編號為ACCC17537、ACCC17558、ACCC17617、ACCC17631 和ACCC17676，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。5 菌株的菌落形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及抗逆性見周冀瓊等［8］的研究。

試驗地為農(nóng)用耕地，平整，肥力均勻。前茬作物為“中苜1 號”紫花苜蓿。

1.3 試驗方法

1.3.1 根瘤菌培養(yǎng) 將供試菌株挑起單菌落接種在YMA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，用無菌水洗脫菌體，接種到Y(jié)MA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃下，搖床中150 r·min－1震蕩培養(yǎng)48 h，用漩渦打旋器混勻菌體，測定OD600nm值，保證田間接種時每粒種子的含菌量大于109。

1.3.2 包衣及拌種

包衣配方及制作。1)傳統(tǒng)根瘤菌吸附劑配方(500 g)的制備:泥炭488.5 g;蔗糖1 g;過磷酸鈣0.5 g;石灰10 g;鉬酸鈉(0. 5%)l mL;硼酸(0.5%)1 mL，121 ℃高壓滅菌30 min。2)將制備好的菌液按1∶ 2的比例加入滅菌后的根瘤菌吸附劑中。3)取15 g 根瘤菌劑加入4 ～5 mL 濃度為4%的粘著劑(羥甲基纖維素鈉)，攪拌均勻，再加入100 g 種子，反復(fù)攪拌，使每粒種子上都粘有根瘤菌劑。4)最后加30 g 膨潤土反復(fù)攪拌，使每粒種子都裹上一層丸衣材料，將丸衣種子置于通風(fēng)處，陰干待用。

液體菌劑拌種:播種量為18 kg·hm－2，拌種時液體菌劑含活菌數(shù)不少于109mL－1，用量1 500 mL·hm－2，菌液與種子混勻后陰干，于當(dāng)天播種。

1.3.3 田間試驗設(shè)計 試驗于2013 年5 －11 月進(jìn)行，采用二因素(接種方式和根瘤菌菌株)隨機區(qū)組設(shè)計，以不含根瘤菌的包衣處理和不含根瘤菌的液體菌劑拌種處理為對照，重復(fù)3 次，共36 個小區(qū)，小區(qū)面積為2.5 m×2 m，小區(qū)與小區(qū)間隔30 cm，四周各有1 m 的保護(hù)行。5 月18 日條播，行距為30 cm，播深為1 ～2.5 cm，每個小區(qū)播種量為9 g。將各處理種子按小區(qū)設(shè)計均勻撒入播種行后覆土。分別于苗期和每次刈割后人工拔除田間雜草，生長期內(nèi)按大田管理進(jìn)行正常灌水排水并及時消滅鼠害。

1.3.4 測定項目及內(nèi)容

于2013 年8 月7 日，在紫花苜蓿初花期時，待植株結(jié)瘤后對每處理小區(qū)進(jìn)行隨機采樣，測定各項指標(biāo)。

地上生物量:進(jìn)行定株試驗，測得苜蓿單株地上干物質(zhì)重量。

根瘤數(shù):每一小區(qū)隨機取10 株苜蓿，挖土深度為30 cm，用水仔細(xì)沖洗后計算單株總根瘤數(shù)和有效根瘤數(shù)。

干草產(chǎn)量:分別于2013 年8 月8 日，9 月29 日，11 月8 日選取生長均勻一致1 m2樣方內(nèi)植株進(jìn)行收獲測產(chǎn)。測定鮮草產(chǎn)量，取一部分樣品在70 ℃烘箱中烘干24 h，計算干草產(chǎn)量，全年共刈割3 茬。

干草粗蛋白質(zhì):用凱氏定氮法［5］測定。

根瘤固氮酶活性用乙炔還原法［9］測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SAS 8.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果。為了使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，統(tǒng)計分析前將各茬及全年干草產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)g 轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式對苜蓿生長和共生固氮效率的影響

采用包衣接種和液體菌劑拌種根瘤菌菌株時，根瘤菌結(jié)瘤數(shù)量、苜蓿單株地上部分干重、苜蓿產(chǎn)量均表現(xiàn)為包衣接種顯著大于液體菌劑拌種(P ＜0.05)，表明包衣接種的效果優(yōu)于液體菌劑拌種，有利于苜蓿生長和提高共生固氮效率(表2)。因此，采用包衣接種方式繼續(xù)研究不同根瘤菌菌株對“中苜1 號”生長和共生固氮效率的影響。

表2 不同接種方式對苜蓿生長和共生固氮效率的影響Table 2 Effects of different inoculation methods on the growth and symbiotic nitrogen fixation efficiency of alfalfa

2.2 包衣接種根瘤菌對苜蓿生長和共生固氮效率的影響

2.2.1 接種根瘤菌對“中苜1 號”苜蓿各茬、全年產(chǎn)量及單株地上部分生物量的影響 5 株根瘤菌包衣接種后，全年苜蓿干草產(chǎn)量均有所提高。前兩茬以及全年總產(chǎn)量各處理間無顯著差異(P ＞0.05)，但不同菌株在不同茬次提高幅度不同(表3)。刈割第1 茬時，接種ACCC17537、ACCC17558 和ACCC17617 菌株效果較好，比對照分別增產(chǎn)42.2%、60.6%和65.9%;刈割第2 茬時，接種ACCC17558、ACCC17617和ACCC17631菌后效果較好，比對照分別增產(chǎn)61.7%、27.7%和21.5%;刈割第3 茬時，ACCC17558 和ACCC17617 菌后效果最好，比對照分別增產(chǎn)41.9%和13.6%，但接種ACCC17558 與ACCC17631 間差異不顯著(P ＞0.05)。從全年干草總產(chǎn)量情況看，菌株ACCC17537、ACCC17558 和ACCC17617 的增產(chǎn)效果較好，比對照分別增產(chǎn)28.2%、57.9%和50.0%。

表3 包衣接種根瘤菌對中苜1 號各茬和全年干草產(chǎn)量及單株地上部分干重的影響Table 3 Effects of seed coating with different rhizobial strains on hay yield and aboveground dry weight of alfalfa

接種根瘤菌后，5 菌株處理與對照間單株地上部分干重差異顯著(P ＜0.05)。對苜蓿單株地上部分生物量貢獻(xiàn)最大的菌株是ACCC17617，單株地上部分干重為0. 350 g，顯著高于其他菌株;其次是ACCC17558 和ACCC17537，分別為0.253 和0.236 g，顯著高于ACCC17631 和ACCC17676。

說明“中苜1 號”分別接種菌株ACCC17558和ACCC17617 后，促進(jìn)苜蓿生長的效果最好。

2.2.2 接種根瘤菌對“中苜1 號”苜蓿結(jié)瘤和固氮的影響 對于“中苜1 號”單株總根瘤數(shù)的影響，5菌株處理均與對照差異顯著(P ＜0. 05)。ACCC17676 結(jié)瘤效果最好，單株總根瘤數(shù)為38.4 個，顯著高于其他菌株;其次是ACCC17617 和ACCC17558，分別為30.7 個和29.5 個，顯著高于ACCC17537 和ACCC17631;ACCC17537 與ACCC17631間差異不顯著(P ＞0.05)。表明菌株ACCC17676、ACCC17617 和ACCC17558 接種能明顯增加苜蓿單株總根瘤數(shù)(表4)。

對于單株有效根瘤數(shù)的影響，5 菌株處理均與對照間差異顯著(P ＜0.05)，ACCC17676 單株有效根瘤數(shù)最多，為34.2 個，顯著高于其他菌株;其次是ACCC17617 和ACCC17558，分別為27.0 個和26.9個，顯 著 高 于 ACCC17537 和 ACCC17631;ACCC17537 與ACCC17631 間差異不顯著(P ＞0.05)。表明菌株ACCC17676、ACCC17617 和ACCC17558接種能明顯增加苜蓿單株有效根瘤數(shù)。

從苜蓿有效根瘤數(shù)與總根瘤數(shù)上看，接種苜蓿比對照有顯著的提高，且單株總根瘤數(shù)和單株有效根瘤數(shù)表現(xiàn)出一致性:ACCC17558、ACCC17617 和ACCC17676 是結(jié)瘤性能強的菌株。

表4 包衣接種根瘤菌對中苜1 號單株根瘤數(shù)、粗蛋白含量及根瘤固氮酶活性的影響Table 4 Effects of seed coating with different rhizobial strains on total and effective nodules，crude protein per plant and nitrogenase activity of nodules

與對照相比，包衣接種5 菌株后，苜蓿植株粗蛋白含量都顯著增加(P ＜0.05)，且各處理間差異較大。單株粗蛋白含量在18.26% ～21.00%，高于對照7.0% ～23.1%，以ACCC17537 含量最高，顯著高于其他菌株;其次是ACCC17617 和ACCC17676，分別為19.16%和19.05%，顯著高于ACCC17558和ACCC17631。表明接種菌株ACCC17537、ACCC17617 和ACCC17676 能明顯提高苜蓿植株地上部分粗蛋白含量。

從固氮酶活性來看，包衣接種5 菌株與對照間以及各菌株間差異均不顯著(P ＞0.05)。且根瘤固氮酶活性與單株地上部分干重、有效根瘤數(shù)、粗蛋白含量等生長性狀指標(biāo)的相關(guān)性不顯著(表5)。

表5 固氮酶活與地上部分干重(DM)、單株總根瘤數(shù)(TN)、單株有效根瘤(EN)及粗蛋白含量(CP)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation among the acetylene reduction and dry weight，total nodules，effective nodules and crude protein

3 討論與結(jié)論

3.1 根瘤菌接種方式對苜蓿生長性狀的影響

本研究結(jié)果表明，在河北南大港鹽堿地區(qū)兩種常用接種方式都有一定的促生、結(jié)瘤及固氮能力，但根瘤菌包衣的效果較好。其原因可能是在鹽堿土壤環(huán)境下，液體菌劑中的根瘤菌缺乏載體的保護(hù)，暴露于鹽堿環(huán)境，無法大量占領(lǐng)結(jié)瘤位點，而根瘤菌包衣由成膜劑、吸附劑和緩蝕劑等配套助劑包裹于種子表面，有逐漸釋放過程，對根瘤菌產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，保證了其成活率，有利于根瘤菌侵染苜蓿植株。

作為根瘤菌應(yīng)用過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，接種方式極大地影響著根瘤菌接種效果。國內(nèi)外的學(xué)者對不同接種方式的效果進(jìn)行了研究，但研究結(jié)果并不完全一致。一些研究表明，液體菌劑更適合某些地區(qū)，或者液體菌劑處理種子和固體菌劑有相當(dāng)?shù)慕臃N效果。如李濤等［10］在田間進(jìn)行根瘤菌Bradyrhizobium japonicum 4302 和Sinorhizobium fredii 4822 拌種、噴施和種下接種3 種接種方式研究，結(jié)果表明大豆(Glycine max)根瘤菌的菌劑拌種方式更適用于黃淮海地區(qū)大豆種植;Tittabutr 等［11］進(jìn)行大田試驗，檢測液體菌劑拌種的結(jié)瘤和固氮能力，發(fā)現(xiàn)液體菌劑和泥炭土為載體的菌劑的表現(xiàn)相似;張紅俠等［12］在田間對根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense 4345 和Sinorhizobium fredii 4338 進(jìn)行3 種方式接種，發(fā)現(xiàn)黃土高原地區(qū)大豆根瘤菌的適宜接種方式是噴施和拌種。而另一些研究獲得的結(jié)論和本研究一致，即顆粒劑如種衣劑的接種效果比液體菌劑更好［13-18］。

3.2 苜蓿生長對包衣接種根瘤菌的響應(yīng)

不同菌株的接種效果存在差異，從對“中苜1號”苜蓿生產(chǎn)效果和品質(zhì)有重要影響的產(chǎn)量、單株地上生物量和粗蛋白含量等方面衡量，菌株ACCC17558 和ACCC17617 表現(xiàn)優(yōu)于其他菌株，具有良好的接種效果，是適合鹽堿土壤和中苜1 號的高效共生菌株。而另一些菌株，如ACCC17537 接種后粗蛋白含量高，但中苜1 號結(jié)瘤效果較差;ACCC17676雖單株根瘤數(shù)多、根瘤固氮酶活性較強，但對中苜1號的生長效果較差。因此，這兩種菌株不符合菌劑生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，不能單獨用于菌劑生產(chǎn)。這與劉曉云等［19］、康俊梅等［5］和Gibson 等［20］的研究結(jié)果類似。馬曉彤［21］的研究表明，中苜1 號接種ACCC17676后植株干重低于對照植株干重，水培試驗中匹配較好的組合是ACCC17676 ―阿爾岡金和ACCC17676―保定苜蓿。

有研究表明，接種的根瘤菌在土壤中生存定殖能力的強弱直接影響著接種的效果［22］。本研究中，干草產(chǎn)量隨著苜蓿生長不斷減少，且全年總產(chǎn)草量增長不明顯。可見，相比接種根瘤菌的影響，土壤環(huán)境可能更顯著影響鹽堿地苜蓿的生長與發(fā)育。但接種根瘤菌對苜蓿的生長有一定的促進(jìn)作用。

本研究中，根瘤菌接種后，全年干草增產(chǎn)最高達(dá)57.88%，粗蛋白含量增加最高達(dá)23.1%，接種效果較明顯，這與喻文虎等［23］和陳利云等［24］研究結(jié)果類似。從各指標(biāo)來看，根瘤固氮酶活性與單株地上部分干重、根瘤數(shù)及粗蛋白含量相關(guān)不顯著，只可以作為參考指標(biāo)?？梢?，中苜1 號苜蓿接種不同根瘤菌后，固氮酶活性可能在不同的菌系間表現(xiàn)出差異，但該差異最終也會體現(xiàn)在單株干重和粗蛋白含量之中?？悼∶返龋?］的研究也得到了類似結(jié)果。因此，不能單純地依據(jù)固氮酶活性的高低確定根瘤菌的固氮能力，必須綜合考慮根瘤數(shù)、結(jié)瘤效率、地上部分干重和環(huán)境因素等指標(biāo)。

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