誘導(dǎo)/封閉自噬相關(guān)基因7對腎癌786-0細(xì)胞自噬的調(diào)控作用研究

王振龍,鄧 騫,王子明

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

·基礎(chǔ)研究·

誘導(dǎo)/封閉自噬相關(guān)基因7對腎癌786-0細(xì)胞自噬的調(diào)控作用研究

王振龍,鄧 騫,王子明

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

目的 探討誘導(dǎo)/封閉Atg7對腎癌786-0細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。方法 構(gòu)建上調(diào)Atg7的慢病毒載體plenti6.3-Atg7，下調(diào)Atg7的慢病毒載體sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv，空載對照慢病毒載體sh-scramb-con lv、plenti6.3-GFP，分別轉(zhuǎn)染腎癌786-0細(xì)胞系，未轉(zhuǎn)染的786-0細(xì)胞系為空白對照。RT-PCR和Western blot檢測各組Atg7的表達(dá),研究plenti6.3-Atg7激活A(yù)tg7效率和sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv抑制Atg7效率。 Western blot檢測上述各組細(xì)胞LCII/LC3I蛋白比值，研究上調(diào)及下調(diào)Atg7對腎癌786-0細(xì)胞自噬的激活及抑制作用。結(jié)果 經(jīng)過篩選，成功構(gòu)建穩(wěn)定上調(diào)Atg7的786-0/plenti6.3-Atg7xbx細(xì)胞系、穩(wěn)定下調(diào)Atg7的786-0/sh-Atg-2 lv細(xì)胞系、空載對照786-0/sh-scramb-con lv、786-0/plenti6.3-GFP細(xì)胞系。與空白對照組比較，Atg7上調(diào)組786-0細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著升高(3.31±0.12vs. 2.23±0.10P<0.01)，具有穩(wěn)定的自噬激活作用；Atg7下調(diào)組的786-0細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著降低(1.45±0.11vs. 2.23±0.10P<0.01)，具有穩(wěn)定自噬抑制作用。結(jié)論 上調(diào)Atg7對腎癌786-0細(xì)胞系具有自噬激活作用，下調(diào)Atg7對腎癌786-0細(xì)胞系具有自噬抑制作用。

自噬；腎透明細(xì)胞癌；自噬相關(guān)基因7；sh-Atg7；plenti6.3-Atg7.

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，其發(fā)病率約以每年2%的速度增長,特別是晚期腎癌病例明顯增加[1]。腎癌中凋亡處于受損和低表達(dá)狀態(tài)，抗凋亡機(jī)制是腎癌細(xì)胞增殖進(jìn)展，并對諸多治療不敏感的原因之一[2]。自噬作為不同于凋亡的細(xì)胞程序性死亡方式，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎癌多種細(xì)胞系及腎癌組織中自噬呈受抑制狀態(tài)，腎癌組織中自噬水平與腫瘤分期、分級負(fù)相關(guān)。提示自噬在腎癌中起誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用[3]。通過調(diào)控自噬能否影響腎癌細(xì)胞增殖以及腎癌自噬的調(diào)控方法，目前文獻(xiàn)報道不多。本研究通過調(diào)控自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes7, Atg7),探討以Atg7作為靶點(diǎn)調(diào)控腎癌786-0細(xì)胞自噬的作用及由此建立自噬激活/抑制腎癌786-0細(xì)胞系模型的可行性，為后續(xù)進(jìn)行腎癌自噬作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用研究人員普遍采用的腎癌786-0細(xì)胞系作為研究對象，細(xì)胞系購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。兔抗人ATG7多克隆抗體，兔抗人Beclin1多克隆抗體購于英國abcam生物公司，兔抗人LC3多克隆抗體購于美國Sigma生物公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購于北京TransGen生物公司，Western-blot Lumious發(fā)光試劑購于美國Millipore公司，N-N’亞甲雙丙烯酰胺購于北京索萊寶生物公司，蛋白Maker購于北京TransGen生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Atg7高表達(dá)慢病毒的構(gòu)建 ①Atg7全基因合成。根據(jù)Genebank提供的人Atg7基因全長序列分析檢查基因內(nèi)部是否含有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列。根據(jù)序列分析結(jié)果，進(jìn)行單鏈oligo合成。利用PCR對合成的oligo進(jìn)行拼接反應(yīng)。將拼接的PCR產(chǎn)物TA克隆到T載體中，將載體轉(zhuǎn)入宿主菌中。測序驗(yàn)證，如有突變，進(jìn)行突變修復(fù)后，再次驗(yàn)證直到序列正確無誤。②設(shè)計(jì)和構(gòu)建Atg7高表達(dá)慢病毒。將目的基因構(gòu)建入plenti6.3-MCS-IRES-GFP載體上，測序驗(yàn)證。將包裝細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期。進(jìn)行Atg7高表達(dá)慢病毒包裝，獲得病毒粗液。微孔過濾清除雜質(zhì)，高速離心濃縮病毒，并測定滴度。將未重組的空載體慢病毒包裝。以上過程均由上海諾百生物有限公司完成。

1.2.2 Atg7低表達(dá)慢病毒及空載體慢病毒的建立 ①sh-Atg7的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)生物信息學(xué)的方法篩選得到2條干擾序列sh-Atg7-1及sh-Atg7-2，其作用于Atg7的位點(diǎn)見表1。根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果合成shRNA。將片段插入構(gòu)建重組質(zhì)粒。②Atg7低表達(dá)慢病毒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒酶切，將啟動子連同插入片段一起轉(zhuǎn)克隆至工作質(zhì)粒。測序驗(yàn)證。Atg7低表達(dá)慢病毒及將未重組的空載體慢病毒包裝。以上過程均由西安博達(dá)生物有限公司完成。

表1 RNA干擾序列的靶向作用位點(diǎn)

名稱序列Atg7上的靶位sh-Atg7-15'-CCGGGGGCCAGTGGGTTTGGATCAACTCGAGTTGATCCAAACCCACTGGCCCTTTTTG靶向609～627位點(diǎn)sh-Atg7-25'-CCGGAAGGAGTCACAGCTCTTCCTTCTCGAGAAGGAAGAGCTGTGACTCCTTTTTTTG靶向691～709位點(diǎn)

1.2.3 Puromycin最低耐受實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行腎癌細(xì)胞786-0的Puromycin最低耐受實(shí)驗(yàn)，及ATG7慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定抗性克隆的篩選。

1.2.4 RP-CR法檢測ATG7基因的表達(dá) 將各種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞以5×105個/瓶的密度種植于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長融合至90%左右時，棄去培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗后，使用Trizol提取各種細(xì)胞總mRNA。使用廣譜分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳對RNA純度進(jìn)行鑒定。結(jié)果進(jìn)一步證明我們提取的mRNA符合實(shí)驗(yàn)對RNA純度的要求。

進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成)，使用TransGen公司TranscriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照說明書步驟進(jìn)行操作。引物設(shè)計(jì)及合成如下：Forward，LC3 5′-GAGCAGCATCCAACCAAA-3′；Revers，5′- CGTCTCCTGGAGGCATA-3′。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)β-actin和各組目的基因的擴(kuò)增曲線和融合曲線，檢查擴(kuò)增的特異性，并求出各個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用IQTM5多重實(shí)時定量PCR儀中自帶的結(jié)果分析軟件求得各樣本的CT值，按照文獻(xiàn)報道的方法，以2-△△CT法計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)與對照組比較的比值。

1.2.5 Western blot法檢測Atg7的表達(dá) 將各種生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×105個/瓶的密度種植于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長融合至90%左右時，棄去培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗后，使用RIPA裂解液提取各種細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。將上述得到的蛋白提取液，加入適量上樣緩沖液后，與沸水中煮8 min，使蛋白得以變性。-20℃冰箱內(nèi)保存。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，檢測目的蛋白。一抗為：Atg7(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)。在凝膠成像系統(tǒng)中照相，以圖片形式保存。蛋白免疫圖像結(jié)果分析。使用Quanlity One圖像分析系統(tǒng)對獲得的圖像進(jìn)行灰度分析。將統(tǒng)一樣品的目的蛋白灰度值和相應(yīng)的內(nèi)參灰度值相比，得到蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值。

1.2.6 Western blot法檢測LC3基因的表達(dá) 方法同上，轉(zhuǎn)膜時間為30 min，一抗?jié)舛葹?∶800。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件對相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較使用ANOVA單因素方差分析，P<0.05表示為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 Atg7慢病毒轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞系結(jié)果構(gòu)建上調(diào)Atg7的慢病毒載體plenti6.3-Atg7及空載對照plenti6.3-GFP，下調(diào)Atg7的慢病毒載體sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv及空載對照sh-scramb-con lv，分別轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞系，未轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞為空白對照組。(圖1)所示，與空載對照組相比，在mRNA水平上，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv顯著上調(diào)和下調(diào)Atg7mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而sh-Atg7-1 lv的下調(diào)作用與空載對照組無差異。在蛋白水平上，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv顯著上調(diào)和下調(diào)Atg7蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而sh-Atg7-1 lv的下調(diào)作用與空載對照組無差異。證實(shí)我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定上調(diào)Atg7的786-0/plenti6.3-Atg7細(xì)胞系和穩(wěn)定下調(diào)Atg7的786-0/sh-Atg-2 lv細(xì)胞系。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染后Atg7的mRNA表達(dá)水平

與plenti6.3-GFP陰性對照相比，plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染細(xì)胞Atg7表達(dá)水平升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與sh-scramb-con lv陰性對照相比，sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞Atg7表達(dá)水平下降，差異具有顯著性(P<0.05)，而sh-Atg-1 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 調(diào)控Atg7基因表達(dá)對786-0細(xì)胞自噬的影響調(diào)控Atg7基因表達(dá)對786-0細(xì)胞自噬的影響見圖2。在蛋白水平上，與空白對照組相比，Atg7上調(diào)組786-0細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著升高(3.31±0.12vs.2.23±0.10，P<0.01)，具有自噬激活作用；Atg7下調(diào)組的786-0細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著降低(1.45±0.11vs.2.23±0.10，P<0.01)，具有自噬抑制作用。通過上調(diào)和下調(diào)Atg7成功構(gòu)建了自噬激活及自噬抑制的786-0腎癌細(xì)胞系。

與786-0細(xì)胞和plenti6.3-GFP陰性對照相比，plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染細(xì)胞Atg7和LC3II蛋白表達(dá)水平升高，差異具有顯著性(P<0.01)；與786-0細(xì)胞和sh-scramb-con lv陰性對照相比，sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞Atg7和LC3II蛋白表達(dá)水平升高，差異具有顯著性(P<0.01)。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后Atg7和LC3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞在不利的外源刺激下通過雙層膜包裹自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)形成自噬體，并降解其內(nèi)容物, 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的代謝需要細(xì)胞器的更新。自噬一方面為細(xì)胞提供能量再循環(huán)，避免凋亡和壞死。另一方面過度自噬導(dǎo)致細(xì)胞必需成分過度清除，引起細(xì)胞發(fā)生不同于凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡——自噬性死亡[4]。自噬與多種疾病特別是腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[5]。通過調(diào)控細(xì)胞自噬，影響腫瘤增殖、侵襲目前已有部分研究。某些腫瘤中通過抑制自噬抑制腫瘤增殖，他莫昔芬可抑制乳腺癌MCF-7自噬，降低了細(xì)胞對不利外源刺激的保護(hù)作用，表現(xiàn)為凋亡增加，抑制腫瘤增殖進(jìn)展，同時也具有放療增敏作用[6]。某些腫瘤中促進(jìn)自噬抑制腫瘤增殖。微管相關(guān)化療藥物(長春新堿、紫杉醇等)可誘導(dǎo)胃癌轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞自噬性死亡。多西紫杉醇可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)而促進(jìn)凋亡，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖侵襲。腎癌多種細(xì)胞系及腎癌組織中自噬呈受抑制狀態(tài)，且自噬水平與腫瘤分期、分級負(fù)相關(guān)。提示自噬在腎癌中起誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用[3]。自噬是否在腎癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,自噬與凋亡的關(guān)系，自噬在誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞死亡中是否占主導(dǎo)地位，調(diào)控腎癌細(xì)胞自噬對腎癌增殖能力的影響及機(jī)制，上述問題尚缺少相關(guān)研究文獻(xiàn)，需要進(jìn)一步研究。選擇一種有效、特異的調(diào)控腎癌細(xì)胞自噬的靶點(diǎn)及方法是上述研究首要解決的問題，也是本研究的目的。

自噬調(diào)控靶點(diǎn)的選擇關(guān)系到調(diào)控效果，目前沒有“金方法”。調(diào)控自噬的方式有外源性調(diào)控和內(nèi)源性調(diào)控兩種。外源性自噬調(diào)控藥物如自噬誘導(dǎo)劑如雷帕霉素(rapamycin)，能夠抑制mTOR，促進(jìn)自噬。自噬抑制劑如氯喹和輕氯喹，能阻斷自噬體和溶酶體融合過程，抑制自噬體成熟及降解。外源性的調(diào)控劑均非特異性地激活或抑制自噬，往往伴隨細(xì)胞其他功能的改變，因此，不適合用于對腎癌自噬作用的研究。自噬的內(nèi)源性調(diào)控以自噬信號通路的調(diào)節(jié)為主要方式，如：雷帕霉素的靶位TOR(target of rapamycin)、PI3K (phosphoinositide-3 kinase)、鈣、激素、氨基酸。Beclin1、LC3(mierotubule-associated protein lightchain3)、Atg7等自噬體形成過程中的關(guān)鍵因子是目前自噬研究中常選擇的調(diào)控靶點(diǎn)。調(diào)控它們的表達(dá)水平就可能實(shí)現(xiàn)對自噬活性的調(diào)控。但Beclin1在常態(tài)下與抗凋亡蛋白Bcl-2相結(jié)合[7]，調(diào)控Beclin1的表達(dá)水平可能直接影響細(xì)胞的凋亡。TIAN等[8]發(fā)現(xiàn)有非Beclin1依賴性的自噬通路，并且與細(xì)胞死亡聯(lián)系緊密，因此調(diào)控Beclin1不是最佳調(diào)控靶點(diǎn)。KUMA等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染并過表達(dá)LC3，LC3有聚集的趨勢，反而不參與自噬體的形成，也不符合研究要求。

Atg7在自噬小體膜的形成和延伸過程中參與了兩種共扼結(jié)合系統(tǒng)。第一種共扼活動里,Atg7和Atg3作為E1和E2兩種生物酶同系物分別參與泛素化的過程，首先Atg8/LC3被半朧氨酸蛋白酶Atg4分解，分解后得到激活了的LC3-I，隨后LC3被Atg7所激活,進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到Atg3。Atg3與Atg8/LC3一起共扼結(jié)合到磷脂酞乙醇胺上形成LC3-II,它是一種脂質(zhì)結(jié)合體,與自噬小體膜的形成有關(guān)[10]。另一個自噬反應(yīng)的共扼活動里,Atg7和Atg10分別作為El和EZ生物酶同系物[11]，Atg7水解ATP并通激活A(yù)tg12，具有活性的Atg12通過Atg10轉(zhuǎn)移到Atgs上，Atgs/ag12復(fù)合物通過非共價鍵結(jié)合Atg16寡聚體化后形成一個大分子復(fù)合物,這種復(fù)合體在Atgs/LC3參與的自噬小體膜形成和延伸過程中起重要作用。Atg7同時參與了Beclin1和LC3的活化，因此，Atg7可能是一種調(diào)控自噬的有效靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究以Atg7作為自噬調(diào)控靶點(diǎn)，獲得滿意結(jié)果[13-14]。而調(diào)控Atg7對腎癌細(xì)胞自噬的作用，鮮有文獻(xiàn)報道，因此調(diào)控Atg7對腎癌細(xì)胞自噬的作用我們進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

我們前期選取了目前腎癌研究中最常使用的具有代表性的4種腎癌細(xì)胞株ACHN、OS-RC-2、769-P、786-0同正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2比較上述腎癌細(xì)胞系自噬水平，研究發(fā)現(xiàn)786-0細(xì)胞系中自噬相關(guān)基因Atg7、Beclin1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平相較其他腎癌細(xì)胞系表達(dá)最低，自噬抑制最明顯，具有較好的典型性[3]，因此，我們選擇786-0細(xì)胞系作為我們研究的細(xì)胞系。

慢病毒載體plenti6.3-Atg7及sh-Atg-1 lv轉(zhuǎn)染腎癌786-0細(xì)胞否具有上調(diào)/下調(diào)細(xì)胞Atg7表達(dá)的作用，本課題進(jìn)行了以下研究。本研究構(gòu)建了自噬相關(guān)基因的Atg7的慢病毒載體plenti6.3-GFP、plenti6.3-Atg7、sh-scramb-con lv、sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv及空載對照細(xì)胞plenti6.3-GFP、sh-scramb-con lv分別轉(zhuǎn)染腎癌786-0細(xì)胞。慢病毒plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞與plenti6.3-GFP空載對照相比，plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Atg7表達(dá)水平升高，差異具有顯著性(P<0.05)。sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv分別轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞與sh-scramb-con lv空載對照組相比，sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞Atg7表達(dá)水平下降，差異具有顯著性(P<0.05)，而sh-Atg-1 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無顯著性差異(P>0.05)。說明慢病毒plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞后可以穩(wěn)定上調(diào)細(xì)胞Atg7的表達(dá)，sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞可以穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞Atg7的表達(dá)。慢病毒plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率均較高，說明通過慢病毒轉(zhuǎn)染及構(gòu)建si-RNA基因敲除方式具有上調(diào)/下調(diào)腎癌786-0細(xì)胞系A(chǔ)tg7表達(dá)的作用。

調(diào)控Atg7對細(xì)胞自噬的作用目前已有部分研究，PATTISON等[12]將Atg7作為自噬調(diào)控點(diǎn)，通過上調(diào)和下調(diào)Atg7的方法到可以達(dá)到調(diào)節(jié)自噬活性的目的，MORTENSEN等[13]也獲得了類似的效果。而調(diào)控Atg7對腎癌自噬的作用鮮有報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，與786-0細(xì)胞空白對照組和plenti6.3-GFP空載對照相比，plenti6.3-Atg7轉(zhuǎn)染細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著升高(P<0.01)，sh-Atg-2 lv轉(zhuǎn)染細(xì)胞LCII/LC3I比值顯著降低(P<0.01)，說明上調(diào)Atg7基因后，細(xì)胞自噬水平升高，下調(diào)Atg7基因后，細(xì)胞自噬水平被抑制。以上結(jié)果提示，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv可以有效的抑制和激活腎癌786-0細(xì)胞的自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬相關(guān)基因Atg-7是有效地調(diào)節(jié)腎癌786-0細(xì)胞自噬水平的方法。并成功構(gòu)建了自噬激活/抑制腎癌786-0細(xì)胞系，為后續(xù)進(jìn)行腎癌自噬作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 王 瑋)

Effect of overexpression/knockdown Atg7 on the autophagy of 786-0 renal clear carcinoma cell lines

WANG Zhen-long, DENG Qian, WANG Zi-ming

(Department of Urology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To explore the regulative effect of autophagy-related gene Atg7 on the autophagy of 786-0 cell line in renal cell carcinoma (RCC). Methods Atg7-overexpression plasmid plenti6.3-Atg7 and Atg7 specific microRNA- expressing plasmid sh-Atg-2 lv were established and identified. Plenti6.3-Atg7 and sh-Atg-2 lv were transfected into 786-0 cells, Western blot was used to detect LCII/LC3I respectively. Results 786-0 cells with Atg7-overexpression and Atg7-knockdown were obtained. Cells with Atg7-overexpression showed increased LC3II/LC3I compared with controls(3.31±0.12vs. 2.23±0.10,P<0.01), while cells with Atg7-knockdown showed reduced LC3II/LC3I compared with controls(1.45±0.11vs. 2.23±0.10,P<0.01). Conclusions 786-0 cells with Atg7-overexpression promote autophagy while 786-0 cells with Atg7-knockdown inhibit autophagy.

autophagy; renal clear cell carcinoma; Atg7; sh-Atg7; plenti6.3-Atg7

2014-09-11

2015-01-22

王子明,主任醫(yī)師,教授.E-mial: ziming-w@263.net

王振龍(1979-),男(漢族),博士,副主任醫(yī)師.研究方向:泌尿系腫瘤及腔內(nèi)微創(chuàng)技術(shù).E-mial:zhenlongw2001@163.com

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-04-016