姜黃素對人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響及機(jī)制探討

丁紅，黃維義，沈桂冬

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2安康市中心醫(yī)院)

姜黃素對人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響及機(jī)制探討

丁紅1，2，黃維義1，沈桂冬2

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2安康市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察姜黃素(CMN)對人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)血紅素氧合酶1(HO-1)蛋白表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。方法采用密度梯度離心法體外分離、培養(yǎng)人臍靜脈血單個核細(xì)胞，以免疫熒光法觀察細(xì)胞吸收Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1情況并同時進(jìn)行CD133免疫熒光鑒定EPCs。將EPCs分為0、5、10、15 μmol/L CMN組，分別以終濃度為0、5、10、15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基孵育24 h，檢測各組HO-1蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖能力及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活力。將EPCs分為單純組、CMN組、CMN+ATRA組，分別在單純培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培養(yǎng)基中孵育24 h，檢測各組HO-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 從臍靜脈血分離出來的單核細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d開始貼壁，7 d后有一定方向性，呈簇狀生長，免疫熒光檢測顯示CD133表面標(biāo)記陽性率及DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性率均>90%。隨CMN濃度升高，EPCs的HO-1蛋白表達(dá)逐漸升高(P均<0.05)，細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)(P均<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力則無明顯改變(P均>0.05)。與單純組比較，CMN組、CMN+ATRA組HO-1蛋白表達(dá)量增加(P均<0.05)，且后兩組比較，P<0.05。結(jié)論CMN可誘導(dǎo)人臍靜脈血來源EPCs高表達(dá)HO-1蛋白，這可能與Nrf2/ARE信號途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞：姜黃素；血紅素氧合酶1；內(nèi)皮祖細(xì)胞

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有增殖、遷移、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞和聚集形成新生血管的作用，主要參與胚胎時期的血管生成，也廣泛參與成人的血管修復(fù)與再生。循環(huán)中EPCs的數(shù)量與功能決定著損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)程度，可作為評估內(nèi)皮功能及獨(dú)立預(yù)測動脈粥樣硬化病程和冠心病患者預(yù)后的指標(biāo)[1]。血紅素氧合酶1(HO-1)是細(xì)胞內(nèi)的一種可誘導(dǎo)的重要保護(hù)酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、應(yīng)對炎癥與氧化應(yīng)激損傷中均發(fā)揮著不可或缺的作用[2]。已有研究[3,4]顯示，人為上調(diào)HO-1表達(dá)可增加循環(huán)中EPCs的數(shù)量與功能，顯著增強(qiáng)對損傷血管的修復(fù)并促進(jìn)缺血梗死區(qū)血管新生，從而改善包括冠心病在內(nèi)的動脈粥樣硬化患者的預(yù)后。近年發(fā)現(xiàn)一種天然的植物藥用成分姜黃素(CMN)，其是HO-1的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，抗炎、抗氧化損傷與組織細(xì)胞保護(hù)作用均有賴于其對HO-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察了CMN對人臍靜脈血來源EPCs中HO-1表達(dá)的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑CMN、全反式視磺酸(ATRA)購自美國Sigma公司；硫氰酸熒光素標(biāo)記荊豆凝集素1(FITC-UAE-1)、Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)和鼠抗人CD133抗體購自R&D SYSTEMS公司；兔抗HO-1抗體(ab13243)購自abcam公司；二抗購自江蘇碧云天生物公司；CCK-8購自碧云天生物研究所；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；新生兒臍靜脈血采集于瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，采集標(biāo)本均經(jīng)患者及家屬同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑配制CMN配制:取CMN(相對分子質(zhì)量368.37)3.683 mg溶于100 μL DMSO中即得到200 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩TRA配制：取10 mg ATRA(相對分子質(zhì)量300.4)溶于3 329 μL DMSO中即得到10 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人臍靜脈血中單個核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及EPCs的鑒定將人臍靜脈血分離獲得單個核細(xì)胞后制成重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/mL后接種于完全培養(yǎng)基的纖連蛋白包板的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2、95%濕度恒溫孵育箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)至第7天，進(jìn)一步用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，24 h后可見少量細(xì)胞貼壁，主要是成纖維細(xì)胞，懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h時，細(xì)胞開始大量貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)闄E圓形并出現(xiàn)集落樣生長傾向；第7天梭形細(xì)胞增多，細(xì)胞生長有一定方向性。培養(yǎng)第7天的細(xì)胞CD133免疫熒光檢測呈綠色，陽性率達(dá)90%以上。取培養(yǎng)第9天的細(xì)胞制作爬片，先后加入內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體FITC-UAE-1、Dil-ac-LDL孵育，熒光顯微鏡觀察見雙染的黃色細(xì)胞達(dá)90%以上。

1.2.3EPCs分組及處理實(shí)驗(yàn)一：將EPCs分為0、5、10、15 μmol/L CMN組，分別以終濃度為0、5、10、15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基孵育24 h；實(shí)驗(yàn)二：將EPCs分為單純組、CMN組、CMN+ATRA組，分別在單純培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培養(yǎng)基中孵育24 h。

1.2.4各組EPCs中HO-1蛋白檢測采用Western blotting法。收集實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二各組細(xì)胞，加入裂解液裂解60 min，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，取上清液以BCA法檢測蛋白濃度。80 V恒壓SDS-PAGE電泳，待蛋白樣品到達(dá)濃縮膠與分離膠交界處時換用150 V繼續(xù)電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST液封閉洗滌，以1∶200一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，以1∶2 000二抗稀釋液室溫下孵育1 h，在PVDF膜上均勻地涂抹化學(xué)發(fā)光底物，棄發(fā)光液，以一層保鮮膜輕輕覆蓋在PVDF膜上，在暗室內(nèi)將X線片置于其上，放入暗盒中曝光5 min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One圖像分析軟件分析其相對表達(dá)量。

1.2.5CMN對EPCs毒性及細(xì)胞增殖的影響取實(shí)驗(yàn)一中各組上清液，按檢測試劑盒說明書方法檢測LDH活力。收集實(shí)驗(yàn)一中各組細(xì)胞，按CCK-8檢測試劑盒說明書方法檢測細(xì)胞增殖能力。

2結(jié)果

2.1CMN對EPCs HO-1蛋白表達(dá)的影響檢測結(jié)果0、5、10、15 μmol/L CMN組HO-1光密度比值分別為0.65±0.02、0.87±0.08、1.25±0.05、1.34±0.03，EPCs的HO-1蛋白表達(dá)量隨CMN濃度的升高而逐漸增加(P均<0.05)。單純組、CMN組、CMN+ATRA組HO-1光密度比值分別為0.47±0.04、1.43±0.02、1.11±0.05，與單純組比較，CMN組、CMN+ATRA組HO-1表達(dá)量增加(P均<0.05)，且后兩組比較，P<0.05。

2.2CMN對EPCs毒性及細(xì)胞增殖的影響CMN對EPCs無明顯毒性損傷作用；CMN濃度越高，EPCs增殖活力越強(qiáng)。詳見表1。

注：與0 μmol/L CMN組比較，*P<0.05；與5 μmol/L CMN組比較，$P<0.05；與10 μmol/L CMN組比較，#P<0.05。

3討論

CMN是從姜黃、郁金等植物根莖中提取的一種生物多酚化合物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有破瘀、行氣、消積和通經(jīng)止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2]顯示，CMN具有抗炎、抗氧化、抑制動脈粥樣硬化、抗病毒等作用。WHO/FAD已允許將其作為天然調(diào)味劑及食用色素使用，近年被廣泛用于化妝品及炎癥治療。研究[5,6]已證實(shí)CMN能誘導(dǎo)多種細(xì)胞高表達(dá)HO-1蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CMN能誘導(dǎo)EPCs表達(dá)HO-1蛋白，且在0~15 μmol/L范圍內(nèi)具有劑量依賴性。HO-1廣泛分布于哺乳動物各種組織細(xì)胞的微粒體內(nèi)，生理狀態(tài)下只有少量表達(dá)，病理狀態(tài)下表達(dá)增多。近年有研究報(bào)道，一些本不具有致氧化應(yīng)激作用的生物黃酮類物質(zhì)也能通過特定的細(xì)胞內(nèi)信號途徑誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。本研究小組也曾報(bào)道銀杏黃酮能通過TPK(酪氨酸蛋白激酶)信號途徑誘導(dǎo)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)HO-1顯著表達(dá)[7]。已知核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一個具有堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的重要細(xì)胞保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子，可在各種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并與DNA的NF-E2區(qū)結(jié)合，而NF-E2區(qū)包含有抗氧化反應(yīng)元件(ARE)序列(GTGACTCAGCA)。ARE是許多抗氧化酶/蛋白基因上游中的順式作用增強(qiáng)元件，Nrf2則參與對ARE的調(diào)節(jié)，從而在ARE介導(dǎo)的抗氧化基因表達(dá)中起重要作用。Nrf2/ARE信號通路能激活其下游的保護(hù)性蛋白HO-1表達(dá)。生理狀態(tài)下Nrf2與胞質(zhì)蛋白伴侶分子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keapl)結(jié)合，其活性處于相對抑制狀態(tài)，在半胱氨酸殘基發(fā)生氧化的情況下，Nrf2與Keapl解耦連后轉(zhuǎn)移入核，與ARE結(jié)合，啟動ARE調(diào)控的抗氧化酶基因如HO-1表達(dá)[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，ATRA主要通過激活視磺酸(RA)的α受體，減少核中的Nrf2與ARE結(jié)合，從而特異性抑制Nrf2-ARE的形成，致使包括HO-1在內(nèi)的抗氧化酶基因表達(dá)減少。尹聞科等[5]報(bào)道，CMN能通過Nrf2/ARE信號通路上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中HO-1表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CMN也是通過Nrf2/ARE信號通路誘導(dǎo)EPCs中的HO-1表達(dá)。但所加用的ATRA并沒有完全阻斷HO-1的表達(dá)，其原因可能是ATRA的用量不足以達(dá)到完全阻斷的效果，也可能是CMN誘導(dǎo)HO-1表達(dá)還存在其他的細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)還監(jiān)測了CMN對EPCs可能存在的毒性作用。LDH是催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)換的酶，廣泛存在于所有組織細(xì)胞中，在細(xì)胞損傷時釋放，且釋放量與細(xì)胞損傷程度呈正比，定量測定培養(yǎng)液中LDH活性即可作為細(xì)胞損傷程度的一種敏感且簡便的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨CMN濃度升高，細(xì)胞增殖活力逐漸增強(qiáng)，而LDH活力卻沒有出現(xiàn)明顯升高，在5 μmol/L CMN時反而降低，這可能與我們的實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)，但LDH的這種變化并沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CMN對EPCs沒有細(xì)胞毒性，并能促進(jìn)細(xì)胞的增殖活力。

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Effect of curcumin on HO-1 expression in endothelial progenitor cells from human umbilical vein blood

DINGHong1,HUANGWei-yi,SHENGui-dong

(1TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of curcumin (CMN) on the HO-1 protein expression in endothelial progenitor cells (EPCs) from human umbilical vein blood and to investigate the mechanisms. MethodsThe mononuclear cells were isolated and cultured by density gradient centrifugation from human umbilical vein blood. The morphology of EPCs was observed with inverted microscope，EPCs were also identified as adherent cells which were double positive for Dil-ac-LDL/FITC- UAE-1 by immumofluorescence method, and their expression of CD133was detected. EPCs were divided into four groups and incubated with 0, 5, 10 and 15 μmol/L CMN respectively for 24 h. Then the HO-1 protein expression, the cell proliferation activity and the Lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant were detected. EPCs were divided into three groups and incubated with 0 μmol/L CMN (simple group), 15 μmol/L CMN (CMN group) and 15 μmol/L CMN+1 μmol/L all-trans retinoic acid (ATRA) (CMN+ATRA group) respectively for 24 h. The HO-1 protein expression was detected. ResultsAttached cells were observed after 3-4 days and cluster growth was noticed after 7 days. The immunofluorescence showed that the positive rate of CD133, the double staining positive rates of DiI-acLDL and FITC-UEA-1 were all more than 90%. With the increase of CMN concentration, the expression of HO-1 protein in the EPCs increased gradually (all P<0.05), and the cell proliferation increased significantly (all P<0.05), but the LDH activity in the supernatant did not change obviously (all P>0.05). Compared with simple medium group, the expression of HO-1 protein in the CMN and CMN+ATRA group increased (all P<0.05), and significant difference was found between the CMN and CMN+ATRA groups (P<0.05). ConclusionCMN may effectively induce the high protein expression of HO-1 in EPCs, which is related with Nrf2/ARE signal pathway.

Key words:curcumin; heme oxygenase-1; endothelial progenitor cells

(收稿日期：2014-11-26)

通信作者簡介：黃維義(1968-)，男，主任醫(yī)師，教授，研究方向?yàn)樾呐K介入治療。E-mail:hwy6881@126.com

作者簡介：第一丁紅(1979-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樾呐K介入治療。E-mail:dinghongyisheng@163.com

基金項(xiàng)目：瀘州市人民政府—瀘州醫(yī)學(xué)院科技戰(zhàn)略合作科技項(xiàng)目(2013LZLY-J15)。

中圖分類號：R329.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.006