高效液相色譜法快速分析手性聯(lián)萘酚的教學(xué)實踐

王秧年, 陸大東, 奚忠華, 葉 濤, 章文偉, 李 琳, 張劍榮

(南京大學(xué) 國家級化學(xué)實驗教學(xué)示范中心, 江蘇 南京 210093)

高效液相色譜法快速分析手性聯(lián)萘酚的教學(xué)實踐

王秧年, 陸大東, 奚忠華, 葉 濤, 章文偉, 李 琳, 張劍榮

(南京大學(xué) 國家級化學(xué)實驗教學(xué)示范中心, 江蘇 南京 210093)

手性聯(lián)萘酚(BINOL)的合成、對映異構(gòu)體拆分及其e.e.值測定是大學(xué)有機化學(xué)實驗教學(xué)的重要內(nèi)容。在教學(xué)過程中,引導(dǎo)學(xué)生自主建立運用高效液相色譜法(HPLC)快速分析手性BINOL合成產(chǎn)物的實驗方法。這不僅有助于拓展學(xué)生的視野、提高他們的實驗技能和科學(xué)素養(yǎng),還能有效地踐行以學(xué)生為主體的教學(xué)實踐。

聯(lián)萘酚(BINOL); 手性; 高效液相色譜法(HPLC); 快速分析; e.e.值

聯(lián)萘酚(BINOL)是具有C2不對稱軸和獨特立體化學(xué)性質(zhì)的聯(lián)芳香族化合物,BINOL及其衍生物合成及其在不對稱催化中的應(yīng)用研究是當(dāng)今科研的熱點和前沿之一[1]。BINOL合成及其拆分產(chǎn)物的HPLC分析是“大學(xué)有機化學(xué)實驗”課程中分層次教學(xué)模式的經(jīng)典實驗之一,但存在分析時間太長(約30 min)等問題。在學(xué)生人數(shù)多而儀器數(shù)量有限的情況下,建立高效液相色譜法(HPLC)快速分析BINOL及其拆分產(chǎn)物的實驗方法就顯得尤其重要。

HPLC分析技術(shù)具有可分析復(fù)雜組分樣品、不受被分析組分熔沸點限制、分析方法靈活、可選擇的流動相種類繁多等優(yōu)點,因而被廣泛應(yīng)用于教學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐[2-9]。據(jù)統(tǒng)計,目前已知的化合物中有20%～25%可用GC分析,其余的原則上均可用HPLC分析[4]。在HPLC技術(shù)分析手性BINOL的本科生實驗教學(xué)中[10],通過對HPLC分析技術(shù)基礎(chǔ)知識的集中講解,讓學(xué)生了解并掌握流動相和手性固定相的種類及其選擇原則,了解流動相的組成、比例、流速等對分離效果的影響。然后,以CH3OH與n-C6H14或H2O組成混合流動相,引導(dǎo)學(xué)生自己建立快速分析方法和優(yōu)化實驗條件、獨立操作儀器完成自己合成和拆分手性BINOL產(chǎn)物的分析測試,深入探討影響分離度和分離時間的原因,在訓(xùn)練和提升學(xué)生動手能力的同時培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力。在實驗教學(xué)過程中,充分發(fā)揮學(xué)生的主觀能動性,訓(xùn)練學(xué)生的實驗?zāi)芰蛨F隊合作精神,使學(xué)生深入了解化學(xué)實驗技術(shù)發(fā)展簡史及其在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中的重要性,提升其實驗技能和科學(xué)素養(yǎng),試圖踐行以學(xué)生為學(xué)習(xí)主體的教學(xué)理念。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1120高效液相色譜儀(美國Agilent公司);合成產(chǎn)物BINOL、拆分的R-和S-BINOL(制備方法見參考文獻(xiàn)[10]),正己烷(HPLC級),甲醇(HPLC級),去離子水,25.00 mL容量瓶,10.0 mL微量進樣器。

1.2 液相色譜分離條件

色譜柱:Chirex(S)-VRL and DnRn 5 mm(4.6 mm× 250 mm);檢測器:紫外檢測器,254 nm;柱溫:30 ℃;流動相:

(1) CH3OH∶n-C6H14(V/V)從60∶40 ～100∶0(即CH3OH的體積分?jǐn)?shù)從0.60～1.00);

(2) CH3OH∶H2O(V/V)=90∶10(即CH3OH的體積分?jǐn)?shù)為0.90);流速:0.60～1.00 mL/min;進樣量:2.00 mL。

1.3 BINOL溶液的配制

配制學(xué)生自己合成的BINOL、拆分產(chǎn)物R-和S-BINOL的甲醇溶液。準(zhǔn)確稱取25.0 mg上述3種BINOL,溶解于甲醇,定容至25.00 mL,備用。依次標(biāo)記為(R,S)-BINOL、R-BINOL、和S-BINOL。

2 結(jié)果與討論

2.1 柱流速的影響

首先考察柱流速對分離效果和柱壓的影響。以CH3OH:n-C6H14(V/V)=75∶25為流動相,柱流速為0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL/min。從圖1a和1b可以清楚地看到,(R,S)-BINOL外消旋體中R-和S-構(gòu)型能夠完全分離。隨著柱流速從0.60 mL/min增加到1.00 mL/min,其保留時間從7.007 min顯著縮短至4.093 min (見圖1c,以保留時間長的色譜峰為例),遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報道的約30 min,即實現(xiàn)了(R,S)-BINOL外消旋體的快速、有效分離。如此短的分析時間能有效地解決學(xué)生人數(shù)眾多而儀器數(shù)量少的矛盾。此外,柱壓從33.67 bar幾乎線性增加至較低水平的65.48 bar,這有助于延長色譜柱的使用壽命。以上述優(yōu)化的分離條件(柱流速1.00 mL/min)分析拆分產(chǎn)物R-和S-BINOL可知,保留時間短的為R-構(gòu)型,見圖1(d)和1(e),而且發(fā)現(xiàn)學(xué)生自己拆分的R-和S-BINOL樣品均未完全拆分,借此引導(dǎo)學(xué)生通過改進拆分條件實現(xiàn)對合成產(chǎn)物(R,S)-BINOL的進一步拆分。

圖1 柱流速對分離效果和柱壓的影響

在流動相的種類和組成比例確定后,結(jié)合HPLC的基礎(chǔ)理論知識,引導(dǎo)學(xué)生探討柱流速與分離效果和柱壓的關(guān)系,根據(jù)上述實驗結(jié)果歸納出隨著柱流速提高保留時間縮短而柱壓升高。由于色譜柱的柱效是柱中流動相線速度(柱流速)的函數(shù),不同的流速可得到不同的柱效,因此,對于一根指定的色譜柱,要達(dá)到最佳柱效,應(yīng)在最佳柱流速下進行分析測試。一般而言,對內(nèi)徑為4.6 mm的色譜柱,流速一般選擇1.0 mL/min,對內(nèi)徑為4.0 mm的色譜柱,流速一般選擇0.8 mL/min。

2.2 流動相組成的影響

流動相極性和粘度對分離效果和柱壓有顯著影響。本實驗選擇強極性的CH3OH與非極性的n-C6H14或與極性的H2O組成流動相,設(shè)定柱流速為1.00 mL/min。CH3OH、H2O和n-C6H14的偶極矩和粘度數(shù)據(jù)見表1[11]。

表1 H2O、CH3OH和n-C6H14的偶極矩和粘度

注:a—c依次為20、25和30 ℃的各物質(zhì)粘度數(shù)據(jù)。

對于CH3OH-n-C6H14流動相,CH3OH的體積分?jǐn)?shù)為0.60、0.70、0.75、0.80、0.90和1.00。在CH3OH體積分?jǐn)?shù)為0.60和1.00條件下,外消旋體的R-和S-BINOL均能夠完全分離,見圖2(a)和2(b)。隨CH3OH體積分?jǐn)?shù)從0.60增加到1.00,見圖2(c),R-和S-BINOL的保留時間略有縮短,以S-BINOL為例,保留時間僅從4.593 min縮短至4.000 min,柱壓也僅從53.41 bar增加至61.61 bar。換言之,CH3OH:n-C6H14流動相中,隨著CH3OH體積分?jǐn)?shù)的增加,流動相的極性和動力學(xué)粘度均增加,保留時間縮短、柱壓增加但二者變化不顯著。

對于CH3OH-H2O流動相,在CH3OH體積分?jǐn)?shù)為0.9和1.00 ml/min柱流速條件下,S-BINOL的保留時間為4.467 min,見圖2(d),與圖2(a)的4.593 min相當(dāng)(CH3OH和n-C6H14混合物中CH3OH體積分?jǐn)?shù)為0.60);但柱壓達(dá)到103.13 bar,約是后者(53.41 bar)的2倍。CH3OH體積分?jǐn)?shù)和柱流速對S-BINOL保留時間和柱壓的影響匯列于表2,可以看到隨著H2O體積分?jǐn)?shù)的增加,柱壓顯著增加和保留時間顯著延長,這可歸因于隨著流動相中H2O體積分?jǐn)?shù)的增加,流動相的極性和動力學(xué)粘度增加。一般而言,高柱壓是應(yīng)該避免的,其可能會給HPLC主機和色譜柱帶來不必要的損傷。

圖2 流動相組成對分離效果和柱壓的影響

CH3OH體積分?jǐn)?shù)柱流速/mL·min-1S-BINOL保留時間/min柱壓/bar1.01.04.00061.610.91.04.467103.130.90.85.57080.780.81.05.303126.570.80.806.990101.650.80.707.64389.67

結(jié)合上述實驗結(jié)果和流動相的物性數(shù)據(jù)可知,流動相的極性和動力學(xué)粘度對BINOL外消旋體的分離效果以及柱壓有顯著影響。CH3OH和H2O都是強極性物質(zhì)而n-C6H14是非極性物質(zhì),其動力學(xué)粘度順序是H2O > CH3OH > n-C6H14。對于CH3OH-H2O流動相,隨H2O含量增加,流動相為極性略有增加的強極性體系,但粘度會顯著增加;而對CH3OH-n-C6H14流動相,隨CH3OH含量增加,粘度會有所增加,流動相極性顯著增加,但顯著低于CH3OH-H2O流動相的極性。因此,柱壓升高主要來源于動力學(xué)粘度和柱流速增加,而保留時間的縮短主要源自柱流速增加。

根據(jù)上述實驗結(jié)果和理論分析,引導(dǎo)學(xué)生探討影響HPLC分離、分析和鑒定復(fù)雜組分混合物的因素。HPLC是基于樣品組分在柱填料與流動相之間物質(zhì)交換而達(dá)到分離的目的,因此流動相的選擇就尤為重要。優(yōu)良的流動相應(yīng)具備以下特征[2-5]:

(1) 應(yīng)具有相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)惰性,要求不能與樣品和固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng);

(2) 對樣品有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀或長時間保留在色譜柱中;

(3) 粘度要盡量小,可以在使用較長的色譜柱時能達(dá)到很好的分離效果,同時能有效降低柱壓、延長液體泵的使用壽命;

(4) 流動相的物性要與使用的檢測器相適應(yīng),對于UV檢測器,最好使用對所使用波段的紫外光吸收盡可能小的流動相;

(5) 沸點不能太低,否則容易產(chǎn)生氣泡。

影響HPLC分離的因素主要包括儀器的靈敏度和穩(wěn)定性、色譜柱的類型和長度、流動相的種類和組成比例、柱流速、柱溫等,其一般性原則歸納為:

首先,根據(jù)待分析樣品的組分確定色譜柱的類型、流動相的種類,要能夠使樣品中各組分不會在柱中沉淀或長時間保留,并且能有效分離各組分。

第二,確定流動相的組成、柱流速及柱溫,在保證分離度的條件下盡可能快地使各組分流出色譜柱,同時要兼顧色譜柱的柱壓不要過高,以盡可能地延長色譜柱的使用壽命。

第三,要考慮流動相的安全性和成本等,盡可能使用廉價的流動相。

最后,簡短介紹手性識別機理,并引導(dǎo)學(xué)生分析Chirex(s)-VRL and DnRn手性柱對BINOL外消旋體的拆分過程的可能機理。Dalgliesh等[12]提出手性分離的主要驅(qū)動力是手性分子與固定相之間特定的-、氫鍵及偶極相互作用的“三點作用”模型。Topiol等[13]用半經(jīng)驗量子力學(xué)方法和分子動力學(xué)方法發(fā)現(xiàn)“三點作用”在2種非對映異構(gòu)體中都存在,認(rèn)為非對映體絡(luò)合物能量差別是立體效應(yīng)(空間匹配)所致、手性分離的驅(qū)動力主要來自范德華力,提出了用距離矩陣預(yù)測手性識別的方法。尤秀麗等[14]在用Chirex 3001手性柱拆分安息香和BINOL及其類似物的對映體時,采用分子力學(xué)方法研究前述對映體與固定相Chirex 3001手性識別過程,結(jié)果表明手性分子和手性固定相之間的-相互作用、氫鍵和范德華作用等呈現(xiàn)出明顯差異,該結(jié)果支持Dalgliesh等提出的“三點作用”手性識別模型。實際上,我們在實驗中使用的Chirex(s)-VRL and DnRn手性柱對(R,S)-BINOL外消旋體的分離過程能夠運用“三點作用”手性識別模型予以定性解釋。

3 結(jié)束語

通過考察流動相組成和柱流速等實驗條件獲得了快速分析手性BINOL的適宜條件,在1.0 mL/min的柱流速和30 ℃柱溫條件下,5 min之內(nèi)即可完成一次分析測試,遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)值(約30 min)。結(jié)合學(xué)生所掌握的理論知識,引導(dǎo)學(xué)生對實驗結(jié)果進行合理的解釋,并在實驗過程中穿插儀器原理、適用范圍、流動相選擇條件以及如何獲得正確實驗結(jié)果的方法和技巧等內(nèi)容,引導(dǎo)學(xué)生自主學(xué)習(xí),取得了良好的教學(xué)效果。

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Teaching practice for rapid analysis of chiral binaphthol by using high-performance liquid chromatography

Wang Yangnian, Lu Dadong, Xi Zhonghua, Ye Tao, Zhang Wenwei, Li Lin, Zhang Jianrong

(Experiment Teaching Center of Chemistry,Nanjing University,Nanjing 210093,China)

Synthesis of chiral binaphthol (BINOL),resolution of its enantiomers,and determination of e.e.value are very important parts for experimental teaching of organic chemistry.During the experimental teaching,an experimental method for rapid analysis of chiral BINOL products is built independently by students by means of high performance liquid chromatography (HPLC).This not only helps them expand their horizons and improve their experimental skills as well as their scientific literacy,but also effectively implements the teaching practice based on a student-centered learning.

binaphthol (BINOL); chiral; high-performance liquid chromatography (HPLC); rapid analysis; e.e.value

2014- 11- 21

國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1103310;1210030); 2010年教育部“質(zhì)量工程”化學(xué)實驗課程優(yōu)秀教學(xué)團隊項目

王秧年(1966—),女,江蘇泰州,學(xué)士,工程師,從事大型儀器管理工作

E-mail：ynwang@nju.edu.cn

李琳(1961—),女,北京,教授,主要從事有機化學(xué)實驗教學(xué)工作.

E-mail：lilin@niu.edu.cn

G642.0

A

1002-4956(2015)6- 0168- 04