改良彗星實驗和RAPD技術(shù)檢測DNA損傷的實驗研究

賴金龍, 胡健慧, 付 倩, 吳 國, 陶宗婭, 張 紅, 羅學(xué)剛

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101；2. 西南科技大學(xué) 生物質(zhì)材料教育部工程研究中心, 四川 綿陽 621010)

改良彗星實驗和RAPD技術(shù)檢測DNA損傷的實驗研究

賴金龍1, 胡健慧1, 付 倩1, 吳 國1, 陶宗婭1, 張 紅1, 羅學(xué)剛2

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101；2. 西南科技大學(xué) 生物質(zhì)材料教育部工程研究中心, 四川 綿陽 621010)

為了有效檢測細胞DNA的斷裂損傷效應(yīng)和堿基突變,對彗星實驗和RAPD技術(shù)進行改進和優(yōu)化,建立了一套快速、穩(wěn)定的實驗流程。結(jié)果顯示,改進后的彗星實驗方法操作簡便、耗時短、實驗結(jié)果穩(wěn)定,較好地解決了脫膠、細胞核分離操作繁瑣、實驗結(jié)果重復(fù)性低等問題;采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系和擴增條件,RAPD擴增條帶清晰,分辨率高,實驗結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性高。將改進和優(yōu)化后的彗星實驗與RAPD技術(shù)結(jié)合,可快速檢測出細胞DNA斷裂和堿基突變的損傷效應(yīng)。

DNA損傷檢測; 彗星實驗; RAPD

1 彗星實驗簡介

彗星實驗(comet assay)也稱單細胞凝膠電泳實驗(single cell gel electrophoresis,SCGE),是一種有效評估細胞DNA損傷的方法[1]。其原理是器官或組織經(jīng)處理(如輻射、重金屬等)后,細胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂,經(jīng)細胞及其核膜裂解后,DNA解旋,在電場作用下,DNA斷片遷移出細胞核,形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短,DNA仍保留在細胞核的范圍,形成圓形或輕微拖尾的圖譜[2]。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同,可分為中性彗星實驗(pH=8.4)和堿性彗星實驗(pH>13)。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷,堿性彗星實驗具有更高的靈敏性,可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷[3-5]。目前,該法已廣泛用于環(huán)境毒理學(xué)、生物監(jiān)測、輻射生物學(xué)等領(lǐng)域[6-10]。但彗星實驗也有一定的局限性,當(dāng)污染物雖已造成細胞DNA斷裂，但尚不足以利用該法顯現(xiàn)時,則導(dǎo)致形成“假陰性”結(jié)果。

近年來廣泛采用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析方法,利用通用引物或設(shè)計特殊引物進行特異性擴增,可有效檢測DNA堿基變化,明顯提高了DNA損傷檢測的靈敏度[11]。其中,隨機擴增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)應(yīng)用隨機引物(通常為10 bp)在非嚴(yán)格條件下進行PCR,基因組的多個位點同時擴增,然后通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物,檢測基因位點的多態(tài)性[12]。若外源污染物造成DNA損傷,引起堿基缺失、替換和插入等突變,隨機引物則無法與結(jié)合位點配對,擴增中斷,導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)量和分子量大小發(fā)生改變,呈現(xiàn)出多態(tài)性,其結(jié)果可定性反映堿基突變或DNA序列的變化[13]。目前,該技術(shù)已應(yīng)用于物種多樣性分類、基因鑒別和系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。

在實驗流程方面,彗星實驗的靈敏度和結(jié)果的重復(fù)性易受低熔點瓊脂糖濃度、裂解時間、電泳緩沖液組分、電泳條件等較多因素的影響;常用的“三明治”型包埋法操作繁瑣、易脫膠[14],機械法分離細胞核的效果不佳等[15],限制了該法的廣泛應(yīng)用。RAPD技術(shù)使用單一引物僅能檢測基因組特定區(qū)域的DNA多態(tài)性,若要檢測整個基因組多態(tài)性,則需篩選一系列隨機引物[13];同時,由于RAPD分析的結(jié)果重復(fù)性不太高,需建立標(biāo)準(zhǔn)化的實驗操作流程和反應(yīng)條件,才能使結(jié)果具有可重復(fù)性[16]。因此,建立一套快速、穩(wěn)定的整合利用彗星實驗和RAPD技術(shù)的操作流程,以期提高DNA損傷檢測的靈敏度和重復(fù)性尤為迫切。

我們基于文獻報道的方法,經(jīng)過改進和優(yōu)化,構(gòu)建了一套操作簡便、耗時短、省耗材、結(jié)果重復(fù)性好的彗星實驗和RAPD技術(shù)操作流程,解決了長期存在的操作復(fù)雜、重復(fù)性低等問題,可快速檢測出DNA斷裂損傷和堿基突變。本文選用毒理學(xué)評價常用的模式植物蠶豆為試材,以銫(Cs+)為外源處理因子,以中性彗星實驗為例并結(jié)合RAPD技術(shù),詳細介紹實驗操作流程及數(shù)據(jù)處理方法,為應(yīng)用彗星實驗和RAPD技術(shù)檢測細胞DNA損傷效應(yīng)提供方法學(xué)指導(dǎo)。

2 試劑與儀器設(shè)備

2.1 儀器設(shè)備

玻璃培養(yǎng)皿;冰盤;冰盒;1～10 mL、10～100 mL、100～1 000 mL移液器和槍頭;1.5 mL 扣蓋離心管;解剖刀;脫色搖床(KB-900);尼龍布(孔徑200 mm);5 mL注射器;天平(精度0.001 g);微波爐;恒溫水浴鍋(HWS26型);載玻片(帶磨砂邊);蓋玻片;水平電泳槽(DYCP 31DN型);穩(wěn)壓電泳儀(DYY-6C型);計時器(YGH115型);徠卡正置熒光顯微鏡(DM3000):100～400倍,藍色激發(fā)光波長460～485 nm;凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+);PCR儀(S1000)等。

2.2 試劑準(zhǔn)備

(1) 實驗試劑。去離子水(ddH2O);重鉻酸鉀洗液(配制方法：稱取重鉻酸鉀20 g,置500 mL燒杯中并加入40 mL蒸餾水,加熱溶解,冷卻后,緩慢加入360 mL濃硫酸,攪勻,冷卻后,裝入棕色瓶中待用);甲醇;0.2mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)4℃預(yù)冷;涂層瓊脂糖溶液(0.5%)(配制方法：稱取250 mg常熔點瓊脂糖,加入50 mL ddH2O,微波加熱溶解,倒入50 mL離心管中,45℃水浴待用);1.5%包埋凝膠溶液(配制方法:150 mg低熔點瓊脂糖加入10 mL PBS緩沖液中,微波加熱溶解,45℃水浴待用(經(jīng)過多次實驗篩選,該濃度的包埋凝膠不脫落));5TBE貯存液(滅菌);電泳緩沖液(0.5TBE,pH 8.4)(配制方法:量取100 mL TBE貯存液,用ddH2O定容至1000 mL,待用);裂解緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用)(配制方法:稱取25 g 十二烷基磺酸鈉(SDS)用電泳緩沖液溶解后,定容至1000 mL,混勻備用);吖啶橙染色溶液(5 mg/L)(配制方法:吸取250 mL、100 mg/L吖啶橙貯備液,用PBS緩沖液稀釋至5 mL,避光保存)。

(2) RAPD實驗。液氮;植物總DNA提取試劑盒、DNA Maker (型號:200 bp DNA Ladder)和2Taq Plus PCR MasterMix購于天根生化科技有限公司;隨機引物由上海生工有限公司合成;0.5TBE電泳緩沖液配制同上。

3 實驗流程

3.1 試材及其處理

蠶豆品種為“成胡一號”(ViciafabaL.),購自成都市種子市場。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,設(shè)置Cs+處理組溶液濃度ρ分別為25、50、100、200 mg/L,依據(jù)文獻報道的目前我國土壤中Cs+的背景值為8.24 mg/kg[17],設(shè)置ρ(Cs+)為8.24 mg/L為對照(記為CK),溶液配制均使用1/6改良霍格蘭營養(yǎng)液。種子經(jīng)消毒、浸種,適溫下萌發(fā)至胚根1 cm左右[18]。選擇胚根長度一致的蠶豆放入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中,分組編號,分別添加CK或Cs+處理液10 mL。培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,避光培養(yǎng)48 h后,一部分蠶豆根尖用于彗星實驗;另一部分蠶豆根尖用于RAPD分析。

3.2 彗星實驗流程

3.2.1 載玻片預(yù)處理

選取一端帶磨砂的載玻片,置于重鉻酸鉀洗液中,浸泡至少30 min后取出,用自來水沖洗,蒸餾水沖洗,晾干后置于甲醇中保存。取一張潔凈的載玻片直接放入裝有50 mL涂層瓊脂糖溶液中(45 ℃),停留5～10 s,取出,觀察載玻片表面凝膠是否懸掛均勻,垂直晾干,可保存1周。

3.2.2 植物組織細胞核懸液的制備

選取處理后的蠶豆根尖6～7個,置于冰盤上的培養(yǎng)皿中,加入1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液,用解剖刀快速切成薄片,將緩沖液和組織薄片轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,放入冰盒內(nèi)(避光),脫色搖床220 r/min,震蕩10 min。

將離心管中的細胞核懸液及組織薄片全部轉(zhuǎn)移到墊有尼龍布圓片(孔徑200 mm)的注射器中,推動活塞,過濾至1.5 mL離心管中,濾液置冰盒內(nèi)保存待用。

3.2.3 細胞核的包埋

將細胞核懸液與包埋凝膠溶液以體積比為1∶3的比例混合(如:取150 μL細胞核懸液,加入450 μL包埋凝膠溶液快速混勻),用槍頭吸取100 μL混合液滴于已預(yù)處理的載玻片上,用潔凈蓋玻片推片,將混合液鋪平,冰盤冷卻。

3.2.4 細胞核膜的溶解及電泳

將已包埋細胞核的載玻片放入培養(yǎng)皿中,倒入適量的核膜裂解緩沖液,裂解30 min后,將載玻片并排放入水平電泳槽中,加入電泳緩沖液(0.5TBE,pH 8.4),室溫,穩(wěn)壓10 V,電泳15 min(此條件下易于觀察到細胞凋亡)。

3.2.5 染色與熒光觀察

取出電泳后的載玻片,置于染色培養(yǎng)皿中,每一張載玻片滴加100 μL吖啶橙染色溶液(5 mg/L),避光染色5 min。染色完成后,流水沖洗多余染液后,放入蒸餾水中保濕,避光待用。

熒光觀察:取出已染色的載玻片,吸去多余水分,置于熒光顯微鏡(物鏡10～40倍,460 nm～485 nm,藍色激發(fā)光)下觀察,采集圖像數(shù)據(jù)并保存,圖片格式TIFF。

3.3 RAPD實驗流程

3.3.1 蠶豆幼苗根尖基因組DNA的提取

剪取適量的蠶豆根尖,在液氮中充分磨碎后,稱取100 mg左右的粉末,參照試劑盒的操作步驟提取蠶豆根尖總DNA,1.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓50 V,時間90 min )檢測DNA純度和濃度后,-2 0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

經(jīng)多次實驗,已獲得最優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件,即:混合體系25 mL,組成成分包括模板(總DNA)1 mL,隨機引物(10 mmol/L)1 mL,2Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μL,滅菌雙蒸水(ddH2O)10.5 μL;實驗所用的通用引物序列如表1。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置為:(1)94 ℃預(yù)變性5 min;(2)94 ℃變性45 s;(3)36 ℃退火復(fù)性45 s;(4)72 ℃延伸90 s;(5)由(2)—(4)循環(huán)45次;(6)72 ℃延伸10 min;(7)PCR反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存。

老陳咧嘴一笑，說那一巴掌啊，打得我都懵了。我活了一把年紀(jì)了，還從沒有人打過我耳光呢。老陳摸了摸臉，皺了一下眉頭，好像疼痛還沒有過去一樣。已到吃晚飯時間，我說去打飯，老陳從枕頭下面抽出一張鈔票來要給我。我說，陳師傅，你要是這樣可就見外了。見我是認(rèn)真的，老陳又把那張鈔票塞回枕頭底下了。我打飯回來，叫老陳吃飯，他身子扭動了一下，似有難言之隱。我問他是不是要小便，他點了點頭，不好意思地笑了笑。我說，陳師傅，有什么事您老盡管吱聲，都是男人，沒有什么不能說的。老陳點著頭，說我這輩子都是伺候別人，還從沒被別人伺候過呢。

反應(yīng)結(jié)束后,取6 mL反應(yīng)產(chǎn)物,RAPD 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,恒壓50 V,時間150 min。實驗用通用引物序列見表1。

表1 實驗所用的10條通用引物序列

4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析

4.1 彗星實驗結(jié)果

DNA與吖啶橙結(jié)合后,在藍色激發(fā)光(460～485 nm)下發(fā)出綠色熒光。正常細胞的DNA未受到損傷,核膜裂解后,主要以超螺旋形式存在,在電流作用下,大分子DNA移動距離較短,熒光集中在細胞核區(qū)域;隨著DNA損傷加劇,出現(xiàn)DNA鏈的斷裂,在電流作用下,斷片(構(gòu)成彗星尾部)遷移出細胞核(構(gòu)成彗星頭部),其遷移距離和彗星尾部DNA含量即可表示DNA的損傷程度[19]。本研究經(jīng)過核膜裂解30 min處理,再進行電泳,可明顯觀察到彗星圖像(見圖1)，圖中數(shù)據(jù)表示ρ(Cs+)為25、50、100、200 mg/L。

圖1 經(jīng)核膜裂解處理的彗星實驗結(jié)果

彗星分析軟件(comet assay software project,CASP)可將圖像轉(zhuǎn)化為彗星常用統(tǒng)計量,其中彗星尾長(Tail length of comet,TL)在一定程度上反映了DNA損傷程度和DNA斷裂片斷的大小;彗尾DNA比例(Percent DNA in the Tail,TD)表示隨DNA損傷加重,尾部DNA含量遞增,頭部DNA含量遞減,則尾部DNA含量比例增加;彗星尾距(Tail moment,TM)表示尾部DNA含量和彗尾長度的乘積,是衡量DNA損傷的基本參數(shù)[20-21]。

采集樣本數(shù)據(jù)后,通過“3D Bars”圖顯示各樣本的詳細統(tǒng)計數(shù)據(jù)(見圖2(a)、(b)、(c)),可見,隨著Cs+濃度增加,樣本中受損傷的細胞數(shù)及損傷程度均明顯增加。將“3D Bars”圖轉(zhuǎn)換成“箱圖”進行統(tǒng)計,結(jié)果(見圖2(d)、(e)、(f))顯示,隨著Cs+濃度增加,TL、TD和TM均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢;當(dāng)ρ(Cs+)=100 mg/L時,TL、TD和TM最高,表明蠶豆胚根出現(xiàn)明顯DNA鏈斷裂。箱圖(圖2(d)、(e)、(f))中的矩形和上下觸須表示蠶豆胚根細胞的彗星實驗參數(shù)值。矩形上下邊緣分別代表25%～75%置信區(qū)間,矩形內(nèi)部的細線、小三角形分別表示中位數(shù)和均值,上下觸須表示最大、最小值。

圖2 用“3D Bars”圖和“箱圖”描述不同濃度Cs+處理對蠶豆根尖DNA的損傷程度

蠶豆根尖經(jīng)液氮研磨后,使用試劑盒提取植物總DNA,經(jīng)電泳檢測,其純度和濃度達到進行PCR擴增的要求(見圖3，圖中M為DNA maker,數(shù)據(jù)表示ρ(Cs+)為25、50、100、200 mg/L),DNA不需再純化。采用已優(yōu)化的PCR擴增條件,以CK組總DNA為模板DNA,以10條隨機引物作為擴增引物,分別進行多態(tài)性擴增,挑選出適用于蠶豆根尖的RAPD擴增引物。結(jié)果見圖4,10條隨機引物中僅5號引物擴增效果不佳(亮度較弱),2號、6號和9號引物擴增出的多態(tài)性片段較多。然后選用這3條引物作為擴增引物繼續(xù)進行單向擴增，結(jié)果見圖5,CK組[ρ(Cs+)=8.24 mg·L-1]和各處理組[ρ(Cs+)25～200 mg/L]均能擴增出清晰的隨機性條帶;與CK比較,各處理組不同程度出現(xiàn)了擴增條帶增加、消失、條帶亮度增強和減弱(圖5“箭頭”)。結(jié)果表明,Cs+可導(dǎo)致蠶豆胚根細胞DNA出現(xiàn)堿基缺失、插入或突變等現(xiàn)象,造成基因的多態(tài)性。

5 討論

通過多次實驗,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致涂膠不均勻的原因主要是載玻片不干凈或有油脂,若采用重鉻酸鉀洗液和甲醇依次浸泡載玻片后,晾干,再涂層瓊脂糖溶液,可較好地克服涂膠不均勻的問題,且可回收載玻片,避免了一次性使用載玻片造成的浪費。

圖3 蠶豆胚根細胞總DNA提取結(jié)果

圖4 采用10條隨機引物對蠶豆胚根細胞總DNA的擴增結(jié)果

圖5 3條(2、6和9號)隨機引物對蠶豆胚根細胞總DNA的多態(tài)性擴增結(jié)果

較常用的植物細胞核的提取主要是酶解分離法和機械分離法[15],酶解分離法的成本較高,耗時長,操作復(fù)雜;機械分離法通過切片和機械震蕩,可快速分離得到適宜濃度的細胞核懸液,操作簡便。本研究發(fā)現(xiàn),提取的細胞核溶液濃度主要受搖床轉(zhuǎn)速和震蕩時間的影響,經(jīng)改進后,選用轉(zhuǎn)速220 r/min、震蕩10 min,可獲得以蠶豆為試材時適宜濃度的細胞核懸浮液。對于其他實驗材料,若細胞核濃度較低,可適當(dāng)增加根尖量;同時應(yīng)根據(jù)實驗材料選擇適宜孔徑的尼龍布,避免因尼龍布孔徑太大、過濾后雜質(zhì)太多而影響觀察。

本研究表明,包埋凝膠的脫膠問題主要與低熔點瓊脂糖濃度和細胞包埋的方法有關(guān),若采用常規(guī)“三明治”法進行細胞核包埋,凝固后需移去蓋玻片[22],此過程極易造成脫膠。改進后,采用“兩層凝膠法”,使用經(jīng)篩選后的1.5%包埋凝膠溶液,以“推片法”鋪展第2層包埋凝膠,不需移去蓋玻片等步驟,較好地解決了脫膠問題,操作方便,效果極佳。

彗星實驗結(jié)果易受電泳條件(如:電泳緩沖液、電壓大小、電泳時間等)的影響,為了避免因電泳條件不同而形成“假陽性”結(jié)果,應(yīng)嚴(yán)格保持電泳條件一致。若采用彗星實驗法檢測細胞凋亡,建議選用低電壓(10 V)、電泳15 min。

由于細胞個體存在差異,彗星實驗參數(shù)(TL,TD,TM)受極值的影響較大,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,若采用均值表示結(jié)果會導(dǎo)致量化意義降低[23]。因此,彗星實驗的統(tǒng)計分析建議采用SPSS 軟件的Explore統(tǒng)計過程和頻數(shù)分布功能,并使用Origin軟件繪制“3D Bars”圖和“箱圖”,用于顯示樣本數(shù)據(jù)的分布情況和樣本處理間差異性的比較。

環(huán)境污染物造成細胞DNA出現(xiàn)斷裂損傷時,也可能會發(fā)生基因組DNA片段插入、缺失或堿基突變,這一類損傷效應(yīng)若采用彗星實驗則難以檢出,RAPD技術(shù)通過使用隨機引物在非嚴(yán)格條件下進行PCR,基因組多個位點同時擴增,通過檢測擴增產(chǎn)物的變化,可有效檢測DNA片段或堿基的變化,靈敏度更高[13],為評估環(huán)境污染物的致突變能力提供了更為詳實的實驗依據(jù)。本研究篩選出一系列適用于蠶豆試材進行RAPD實驗的隨機引物,同時優(yōu)化了PCR擴增體系,使擴增結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性強。

綜上所述,通過對彗星實驗方法和RAPD技術(shù)的改進和優(yōu)化,建立了適用于蠶豆試材的彗星實驗流程(見圖6)和RAPD技術(shù)流程(見圖7),可快速檢測出細胞DNA斷裂損傷效應(yīng)和DNA堿基突變。

圖6 檢測DNA斷裂損傷效應(yīng)的彗星實驗流程

圖7 檢測DNA堿基突變的RAPD實驗流程

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Experimental study of improvements on comet assay and RAPD for detecting DNA damage

Lai Jinlong1, Hu Jianhui1, Fu Qian1, Wu Guo1, Tao Zongya1, Zhang Hong1, Luo Xuegang2

(1. Life Science College,Sichuan Normal University,Chengdu 610101,China; 2. Engineering Research Center of Biomass Materials(SWUST) of Ministry of Education, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010,China)

This article studies the improvement and optimization of two methods on the technique process of the comet assay and the RAPD reactive conditions,and the establishment of the quick and stable experiment process for detecting effectively the effects of DNA damage in cells.The results show that the agarose gel debonding,very complex results of the nucleus separation and low repeatability of experimental results are better solved by the improved comet assay and the method is simple and rapid for analysing the DNA damage degree.By optimizing the different RAPD reaction conditions,the stripes of amplification are better distinctive,the resolution is higher and there are good repeatability.The results indicate that the rupture damage and the base mutation of DNA could be detected quickly and efficiently by the combination the comet assay with the RAPD technique.

detecting DNA damage; comet assay; RAPD

2014- 11- 13 修改日期：2015- 01- 14

國家核設(shè)施退役及放射性廢物治理科研重點項目(14ZG6101)；四川省教育廳重點課題(14ZA0030)；四川省生物質(zhì)改性材料工程技術(shù)研究中心(西南科技大學(xué))開放課題(12zxbk03)；四川師范大學(xué)校級青年課題(14qn07)；四川師范大學(xué)實驗技術(shù)課題(SYJS2014-13)

賴金龍(1991—)，男，四川綿陽，碩士研究生，研究方向為生態(tài)毒理學(xué)

E-mail：599101592@qq.com

陶宗婭(1957—)，女，四川成都，博士，教授，研究方向為植物逆境生物化學(xué)與分子生物.

E-mail：t89807596@163.com

Q-331

A

1002-4956(2015)6- 0045- 06