利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆長片段基因的研究

蘭 泓,張玉祥

·論著·

利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆長片段基因的研究

蘭 泓,張玉祥

目的 采用不依賴連接反應的克隆法，利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆Notch2長片段基因。方法 將難以擴增的Notch2 cDNA的編碼序列(7416 bp)人為分成3段，引物設(shè)計時對此3個片段和載體骨架的引物進行堿基硫代磷酸化修飾，用這些引物擴增Notch2的3個片段和載體骨架。然后用T7核酸外切酶分別處理PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生4個具有3′互補突出末端的片段，并將此4個末端突出的片段退火復性，完成Notch2基因克隆。結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Notch2 3個片段和載體骨架的PCR產(chǎn)物大小與預期大小相符，經(jīng)退火復性獲得的克隆通過PCR、酶切和測序進行克隆鑒定，確定Notch2編碼序列已經(jīng)插入到pcDNA3.0-3*Flag載體中。結(jié)論 利用T7核酸外切酶和引物的堿基磷酸化修飾進行的不依賴連接反應的克隆方法能夠用于長片段基因的克隆。

Notch2基因；長片段；不依賴連接反應；T7核酸外切酶；引物硫代磷酸化修飾

Notch家族蛋白在細胞分化、發(fā)育過程中起重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。哺乳動物Notch家族有4個Notch受體(Notch1～4)。雖然這4個Notch蛋白的基本結(jié)構(gòu)相同，但是它們也有各自不同的特點和功能[1-2]。為了進一步研究Notch蛋白的功能，克隆Notch基因是必要的。Notch2基因cDNA全長11 474 bp，其編碼序列7416 bp。一般PCR通常能擴增2～3 kb以內(nèi)的短片段，對于5 kb以上的長片段很難有效擴增，而且7 kb的長片段與載體的連接效率也比較低，所以采用經(jīng)典的限制性內(nèi)切酶方法克隆Notch2基因是比較困難的。本研究利用T7核酸外切酶和引物硫代磷酸化修飾來完成Notch2基因的克隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：PrimeSTAR GXL DNA polymerase及其緩沖液和dNTP為Takara產(chǎn)品，購自寶生物工程(大連)有限公司；TransStart FastPfu DNA聚合酶和TransT1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA液體回收和膠回收試劑盒為MN產(chǎn)品，購自北方儀濤商貿(mào)有限公司；T7核酸外切酶為NEB產(chǎn)品，購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒為Omega產(chǎn)品，購自普京康利生物科技有限公司；10×退火緩沖液自行配制(100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 1 mmol/L NaCl; 10 mmol/L EDTA)；LB細菌培養(yǎng)液自行配制(胰蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、NaCl 10 g/L)。pcDNA3.0-3*flag質(zhì)粒由本實驗室自行構(gòu)建。

1.1.2 引物:本實驗所有引物(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物及其序列

注：*表示經(jīng)硫代磷酸化修飾

1.2 方法

1.2.1 擴增載體骨架和長片段基因Notch2：以線性化載體pcDNA3.0-3*flag為模板，在TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下擴增載體骨架。以BxPC3細胞系的cDNA為模板，TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下擴增Notch2片段A和片段B，在PrimeSTAR GXL DNA聚合酶的作用下擴增Notch2片段C。相應的擴增引物見表1。PCR條件：95℃預變性2 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸2～3 min(Notch2片段A和片段B延伸2 min、Notch2片段C和載體骨架延伸3 min)，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.2 T7核酸外切酶處理、退火復性：分別取已純化的0.5 μg Notch2 3個片段(A、B、C)和1.0 μg載體骨架，T7核酸外切酶在25℃酶切5 min后，用PCR液體回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。Notch2的3個已純化酶切產(chǎn)物按等摩爾比混合，加上0.5倍摩爾數(shù)的已純化載體骨架酶切產(chǎn)物進行退火復性。退火程序為：75℃ 10 min后，每隔90 s降1℃，直至降到25℃。

1.2.3 退火產(chǎn)物的克隆及鑒定:退火產(chǎn)物按照常規(guī)細菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化TransT1感受態(tài)細胞，以已純化的載體骨架酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為陰性對照。挑取2個單克隆按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，通過BamHI和NdeI酶切和PCR鑒定出陽性克隆。質(zhì)粒PCR用pcDNA3.0-3*Flag載體上的通用引物T7和SP6擴增。酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物都通過瓊脂糖凝膠電泳以觀察其條帶位置。最后，將酶切和PCR鑒定均為陽性的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序時使用載體上的測序通用引物T7和SP6分別進行正向和反向測序。

2 結(jié)果

2.1 3個Notch2片段和載體骨架PCR擴增 將難以擴增的長片段基因Notch2的cDNA編碼序列分成3個片段(A、B、C)，其片段大小分別為1877、2504、3095 bp。PCR擴增這3個片段以及pcDNA3.0-3*Flag載體骨架(5432 bp)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示片段A、B、C和載體骨架4個樣品分別在2、2～3、3 、5～6 kb處有明顯特異條帶，且與預期大小均相符。PCR結(jié)果見圖1。

2.2 質(zhì)粒酶切鑒定 挑取2個單克隆，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用BamHI分別對質(zhì)粒進行單酶切鑒定，結(jié)果顯示在10 kb以上出現(xiàn)單酶切條帶；用NdeI分別對質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果顯示在5～6、0.7～0.8 kb處出現(xiàn)明顯條帶；用NdeI和BamHI分別對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳可見4條條帶，位于5～6、3.0、0.7～0.8 kb處。除了NdeI的酶切結(jié)果只顯示2條條帶，其他酶切(BamHI單酶切和BamHI、NdeI雙酶切)條帶位置與預期的大小相符，基本可說明所挑取克隆為陽性克隆。質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 質(zhì)粒PCR 重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見約8.0 kb處明顯特異性條帶，與預期大小相符(7570 bp)，見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR結(jié)果

2.4 測序 將2個基本鑒定為陽性的重組質(zhì)粒用載體上通用引物T7和SP6進行雙向測序。測序證實，Notch2編碼序列很好地裝載入pcDNA3.0-3*Flag載體中，而且通過測序獲得的Notch2序列與GeneBank中登錄號為NM_024408的Notch2序列一致。兩個質(zhì)粒均測序成功，但圖4只顯示其中1個質(zhì)粒的測序結(jié)果。

3 討論

基因克隆技術(shù)是分子生物學常用的實驗技術(shù)。這項技術(shù)從20世紀70年代發(fā)明以來，經(jīng)歷了許多改進和發(fā)展。到目前為止，已經(jīng)有多項基因克隆技術(shù)出現(xiàn)，包括限制性內(nèi)切酶克隆法、TA克隆、不依賴連接酶的克隆方法[3]、GateWay 技術(shù)[4]等。這些技術(shù)各有特點,其中的限制性內(nèi)切酶克隆法最為經(jīng)典，也最為廣泛應用。本實驗室曾經(jīng)試圖通過限制性內(nèi)切酶的方法克隆Notch2基因，但克隆失敗，其原因就在于未能直接從cDNA中擴增出Notch2編碼序列(7.416 kb)全長。因此，面對這么長的DNA序列的克隆，選擇不依賴連接反應的克隆方法(ligation-independent cloning, LIC)。

A

B

LIC是利用具有核酸外切活性的DNA修飾酶分別處理目的片段和載體的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生5′或3′突出互補末端，利用突出的互補末端之間的退火互補進行基因克隆。該方法克服了高背景、低連接效率和受限制性內(nèi)切酶酶切位點限制等問題，被許多研究者用于質(zhì)粒構(gòu)建中[5-6]。最初在1990年Aslanidis和de Jong創(chuàng)建該方法的時候是使用T4 DNA聚合酶處理PCR產(chǎn)物[3]，隨后其他DNA修飾酶也運用到此方法中，如核酸外切酶III[7]、λ核酸外切酶[8]、尿嘧啶-DNA糖基化酶[9]、USER酶(尿嘧啶特異切除反應酶)[10-11]等。本實驗使用具有5′→3′核酸外切活性的T7核酸外切酶處理PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生3′突出互補末端，通過突出末端間的簡單退火復性，將Notch2基因裝載入pcDNA3.0-3*Flag載體中。至于多個DNA片段的無縫克隆，只要用于PCR的引物沒有附加其他序列就可以做到。Li和Elledge[12-13]于2007年建立的不依賴序列和連接反應的克隆方法(sequence-and ligation-independent cloning, SLIC)能夠做到無縫克隆，但是該方法是通過控制T4 DNA聚合酶的處理時間以及加入dCTP來終止酶切反應?；趬A基硫代磷酸化的克隆方法也是SLIC[14]，同樣能夠做到無縫克隆。Blanusa等[14]在確立該方法時是在堿性溶液中加入碘(乙醇)來切斷堿基間的硫代磷酸鍵。本實驗則是通過堿基的硫代磷酸化修飾，以攔截T7核酸外切酶的酶切，從而控制酶切程度。

因為7 kb長的Notch2序列難以直接從cDNA中擴增得到，本實驗將Notch2編碼序列人為分成易于擴增的3個片段，片段大小分別在2～3 kb。為了使3個Notch2片段之間達到無縫拼接，引物設(shè)計時沒有添加多余序列，而且在引物中引入堿基的硫代磷酸化修飾。堿基的硫代磷酸化修飾能夠阻止T7核酸外切酶對底物的水解[15-17]，也就是說，當T7核酸外切酶5′→3′逐個水解底物DNA遇到硫代磷酸化修飾堿基的時候，其水解過程會受到減弱或抑制。Nikiforov等[17]的實驗證明4個堿基的硫代磷酸化修飾能夠完全阻止此水解過程(室溫酶解1 h)，但這也增加了實驗成本。本實驗在適當控制T7核酸外切酶酶解DNA底物的溫度和時間(25℃酶解5 min)的前提下，只對1個堿基進行硫代磷酸化修飾，一方面節(jié)約了試劑費用，另一方面能較好地控制其酶切程度，獲得符合實驗條件的3′突出互補末端。

為了驗證構(gòu)建好的質(zhì)粒的確是Notch2基因的質(zhì)粒，本研究采用3種方法來鑒定。第1種方法就是選用BamHI和NdeI進行質(zhì)粒的單酶切和雙酶切。Notch2重組質(zhì)粒中存在3個NdeI酶切位點，分別位于載體片段、Notch2片段A和片段C中，而BamHI酶切位點僅分布在Notch2片段B中。這樣通過BamHI和NdeI雙酶切酶切產(chǎn)物的大小就可以判斷這4個片段是否存在、是否完整及其連接順序是否正確。圖2顯示，BamHI單酶切時大于10 kb的位置有一明顯的特異條帶。NdeI單酶切后在800 bp和6.0 kb處有條帶，似乎與預期的酶切后3條條帶(789 bp及5.8、6.3 kb)不符。但仔細觀察6.0 kb處的條帶便可發(fā)現(xiàn)，與相鄰泳道同一位置的條帶相比，這條條帶寬度和亮度幾乎是相鄰條帶的兩倍，而且該電泳凝膠的濃度為1.1%，此濃度的凝膠極有可能無法分辨5.8 kb和6.3 kb的條帶，因此，NdeI單酶切后極有可能有789 bp及5.8、6.3 kb 3個酶切片段。再者，通過BamHI和NdeI雙酶切的結(jié)果進一步確定Notch2重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI單酶切酶切產(chǎn)物有789 bp及5.8 、6.3 kb 3個片段。Notch2重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和NdeI雙酶切，酶切產(chǎn)物理論上應該有4個片段(789 bp及2.7、3.1、6.3 kb)，圖2的結(jié)果與理論上的預期結(jié)果相符。第2種方法就是重組質(zhì)粒PCR。使用載體上的通用引物T7和SP6擴增重組質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示8.0 kb左右處有一條明顯的特異條帶，這也與預期的PCR產(chǎn)物大小(7570 bp)相符。通過這兩種方法基本可以確定構(gòu)建好的重組質(zhì)粒是目的質(zhì)粒。第3種方法是對重組質(zhì)粒測序。本實驗使用pcDNA3.0-3*Flag載體的測序引物T7和SP6進行雙向測序。測序確定，Notch2編碼序列與pcDNA3.0-3*Flag載體很好拼接，而且通過測序獲得的Notch2序列與GeneBank中登錄號為NM_024408的Notch2序列一致。

這3種方法從多個角度證實了通過本實驗方法克隆獲得的重組質(zhì)粒為pcDNA3.0-3*Flag-Notch2目的質(zhì)粒:第一，從重組質(zhì)粒PCR結(jié)果來看，PCR擴增獲得的插入到載體中的Notch2片段大小與Notch2編碼序列全長相符；第二，從重組質(zhì)粒酶切結(jié)果來看，Notch2的3個片段和載體骨架均存在該于重組質(zhì)粒中，而且其前后排列順序也是正確的；第三，從重組質(zhì)粒PCR和酶切結(jié)果來看，該重組質(zhì)粒是完整的；第四，從測序結(jié)果來看，pcDNA3.0-3*Flag載體和Notch2基因的拼接是無誤的，且插入載體的片段確定為Notch2基因。

本研究在引物設(shè)計時引入堿基硫代磷酸化修飾，并用T7核酸外切酶處理目的片段和載體的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生3'突出互補末端，突出互補末端間的退火復性而重組DNA,成功構(gòu)建了pcDNA3.0-3*Flag-Notch2重組質(zhì)粒。該方法的成功運用為長片段基因的克隆提供了一種思路。

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Research of Long Fragment Gene Cloning Using T7 Exonuclease and Phosphorothioated Primers

LAN Hong， ZHANG Yu-xiang

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

Objective To clone the long coding sequence of Notch2 using T7 exonuclease and phosphorothioated primers by the ligation-independent cloning method. Methods The long coding sequence of Notch2 (7416 bp) was artificially divided into three fragments because it was difficult for PCR amplification. The primers, which were used to amplify three Notch2 fragments and the vector backbone, were phosphorothioated respectively. The three fragments of Notch2 and the vector backbone were amplified by the primers, and the PCR products were digested by T7 exonuclease, and then four fragments with 3′ complementary single-stranded overhangs were produced. The complementary ends were annealed, and the Notch2 cloning was performed. Results The result of agarose Gel electrophoresis showed that PCR products of three Notch2 fragments and the vector backbone were consistent to the expectation in size. The recombinant of pcDNA3.0-3*Flag-Notch2 was confirmed successfully by PCR, enzyme digestion and DNA sequencing. Conclusion The long fragment gene can be cloned successfully by the ligation-independent cloning method using T7 exonuclease and phosphorothioated primers.

Notch2 gene; Long fragment; Ligation-independent cloning; T7 exonuclease; Phosphorothioated primer

100069 北京,首都醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系

R349.61

A

2095-140X(2015)08-0051-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.013

2015-05-16 修回時間：2015-06-07)