胰島素和丙酮酸乙酯聯(lián)合治療拮抗嚴重燙傷后MODS大鼠炎癥反應和氧化應激的實驗研究

陳榮劍,王占科,張曉云,王建東,祝仲珍,熊圓圓,蘭小鵬,汪仕良

·論著·

胰島素和丙酮酸乙酯聯(lián)合治療拮抗嚴重燙傷后MODS大鼠炎癥反應和氧化應激的實驗研究

陳榮劍,王占科,張曉云,王建東,祝仲珍,熊圓圓,蘭小鵬,汪仕良

目的 觀察胰島素(INS)和丙酮酸乙脂(EP)拮抗嚴重燙傷后多器官功能不全綜合征(MODS)大鼠炎癥反應和氧化應激的效果。方法 將80只SD清潔級30%體表面積Ⅲ度燙傷MODS大鼠隨機分為INS治療組(INS組，n=20)、EP治療組(EP組，n=20)、INS和EP聯(lián)合治療組(INS+EP組，n=20)及治療對照組(對照組，n=20)。INS組、EP組、INS+EP組及對照組分別腹腔注射INS[2.0 U/(kg·d)]、EP[40 mg/(kg·d)]、INS+EP[2.0 U(kg·d)+40 mg/(kg·d)]及等體積林格液。測定并比較各組傷前及傷后1、3、5、7 d血糖、丙氨酸轉氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酐(Cr)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAC)。結果 INS組、EP組和INS+EP組傷后各時點血糖、ALT、CK-MB、Cr及血TNF-α、HMGB1和MDA水平均明顯低于對照組(P<0.01)，TAC水平明顯高于對照組(P<0.01)；INS+EP組傷后各時點血ALT、CK-MB、Cr、TNF-α、HMGB1和MDA水平均明顯低于INS組和EP組(P<0.01)，TAC水平明顯高于INS組和EP組(P<0.01)；INS+EP組和INS組傷后各時點血糖均明顯低于EP組(P<0.01)，INS+EP組傷后各時點血糖和INS組比較無顯著差異(P>0.05)，INS組傷后各時點血TNF-α、HMGB1、TAC水平均明顯低于EP組(P<0.01)，血MDA水平均明顯高于EP組(P<0.01)。結論 INS和EP可有效降低嚴重燙傷后MODS大鼠機體過度炎癥反應和改善氧化應激程度，但作用各有側重，二者聯(lián)合治療效果優(yōu)于單獨治療。

燒傷；多器官功能不全綜合征；胰島素；丙酮酸乙酯；炎癥因子；氧化應激指標；大鼠，Sprague-Dawley

多器官功能不全綜合征(MODS)指嚴重感染、創(chuàng)傷或大手術后同時或相繼發(fā)生的兩個系統(tǒng)或器官出現(xiàn)功能不全或障礙的并發(fā)癥，MODS晚期病死率高。嚴重創(chuàng)傷后并發(fā)腸源性感染造成內毒素血癥，誘發(fā)機體過度炎癥反應、氧化應激和高血糖應激等促進MODS發(fā)生與發(fā)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素(INS)治療不僅可以有效控制高血糖而且具有抗炎和保護肝臟功能作用[2-3]，丙酮酸乙酯(EP)不僅具有抗氧化作用也具有抗炎效果[4-5]，但胰島素和EP聯(lián)合治療拮抗炎癥和氧化應激效果如何，國內外報道不多。為此，本研究以30%體表面積(TBSA)的Ⅲ度嚴重燙傷內毒素血癥伴MODS大鼠作為嚴重創(chuàng)傷MODS動物模型，觀察胰島素和EP單獨和聯(lián)合治療對血漿腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)等炎癥因子和丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAC)等氧化應激指標的影響,探討胰島素和EP聯(lián)合治療嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥的分子機制，為臨床應用和推廣胰島素和EP作為嚴重創(chuàng)傷內素素血癥的治療藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康SD大鼠80只，體質量為(200±15)g,雌雄各半[江西中醫(yī)學院實驗動物中心提供,動物生產許可證SCXK(贛)2013-0001，質量合格證：1308112]。

1.2 試藥與試劑 長效甘精胰島素注射液[賽諾菲(北京)制藥有限公司，批號:20140052，規(guī)格:300 U/3.0 ml];EP(美國Sigma公司，純度98%，密度1.045 g/ml，分析純)；內毒素(LPS,E.coli O111:B4，美國Sigma公司,分析純)。血漿TNF-α和HMGB1酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒均由美國Sigma公司生產。MDA化學比色法檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術股份有限公司。TAC化學終點比色法檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術股份有限公司。血糖、血丙氨酸轉移酶(ALT)、血肌酐(Cr)和血肌酸激酶同工酶(CK-MB)生化檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物技術有限公司。

1.3 儀器 YXJ-2型離心機由江蘇常州萬合儀器有限公司生產，HH-W21型電熱恒溫水浴箱由上海醫(yī)用恒溫設備有限公司生產，BIO-RAD550型酶標儀購自美國伯樂BIO-RAD公司，AU2700型全自動生化分析儀購自美國貝克曼公司。

1.4 動物模型制作和分組 80只SD大鼠在解放軍94醫(yī)院動物實驗室清潔級大鼠實驗環(huán)境下進行適應性喂養(yǎng)3 d，傷前1天進行尾靜脈采血，標本作為正常對照組，然后參考文獻[6]進行乙醚麻醉，背部剪毛后，浸入(92.0±2.0)℃水中20 s，造成30% TBSA Ⅲ度燙傷，傷后2 h按5 mg/kg體重腹腔注射內毒素(1.0 mg/ml,5.0 ml/kg)，同時腹腔注射生理鹽水3.0 ml抗休克，傷后1 d肝功能、腎功能和心肌酶明顯高于傷前并持續(xù)到傷后7 d，為MODS模型制作成功。將制備后的嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥MODS模型大鼠按照隨機數(shù)字法隨機分為INS治療組(INS組)、EP治療組(EP組)、INS和EP聯(lián)合治療組(INS+EP組)、治療對照組(對照組)，每組20只。

1.5 治療方式和檢測指標 ①INS組：配制林格液(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣終濃度分別為8.6、0.3、0.28 g/L)，然后用林格液配制終濃度為0.2 U/ml的甘精胰島素治療液，于大鼠傷后6 h，參考文獻[7]按2.0 U/(kg·d)劑量腹腔注射甘精胰島素、1/d，連續(xù)7 d。②EP組：用林格液配制終濃度為80.0 mg/ml的EP治療液，于大鼠傷后6 h，參考文獻[8]按40 mg/(kg·d)劑量腹腔注射EP治療液、1/d，連續(xù)7 d。③INS+EP組：用林格液配制終濃度分別為0.2 U/L和80.0 mg/ml的甘精胰島素和EP治療液，于大鼠傷后6 h，分別按2.0 U/(kg·d)和40 mg/(kg·d)劑量同時腹腔注射甘精胰島素和EP治療液、1/d，連續(xù)7 d。④對照組：于大鼠傷后6 h，注射等體積林格液、1/d，連續(xù)7 d。

1.6 觀察指標 統(tǒng)計各組傷前及傷后1、3、5、7 d大鼠存活情況，計算7 d存活率。各組大鼠傷前及傷后1、3、5、7 d進行尾靜脈采血，采血前禁食8 h，肝素抗凝混勻，離心，分離血漿，-80℃超低溫保存。各組血標本統(tǒng)一凍融，嚴格按照各指標檢測試劑盒說明書進行各項指標測定：空腹血糖、ALT、Cr和CK-MB采用酶法在全自動生化分析儀上進行測定。血漿TNF-α和HMGB1采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法在酶標儀上進行測定，血漿MDA采用化學比色法、血漿TAC采用終點比色法分別在全自動生化分析上進行測定。

2 結果

2.1 大鼠存活情況 INS+EP組傷后7 d存活率為85%，另3組存活率為80%，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥多器官功能不全綜合征模型大鼠不同時點存活情況(只)

注：INS為胰島素，EP為丙酮酸乙酯;INS+EP組為同時腹腔注射甘精胰島素和丙酮酸乙脂治療液，INS組為腹腔注射甘精胰島素，EP組為腹腔注射丙酮酸乙脂治療液，對照組為腹腔注射等體積林格液

2.2 大鼠血糖和主要臟器功能指標變化 對照組傷后各時點血糖、ALT、CK-MB和Cr均明顯高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；INS+EP組、INS組、EP組傷后各時點ALT、CK-MB和Cr均明顯低于對照組(P<0.01)，且INS+EP組明顯低于INS組和EP組(P<0.01)；INS+EP組和INS組傷后各時點血糖明顯低于EP組(P<0.01)，INS+EP組和INS組血糖水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥多器官功能不全綜合征模型大鼠血糖、ALT、CK-MB和Cr水平變化

注：INS為胰島素，EP為丙酮酸乙酯，ALT為丙氨酸轉氨酶，CK-MB為肌酸激酶同工酶，Cr為肌酐;INS+EP組為同時腹腔注射甘精胰島素和丙酮酸乙脂治療液，INS組為腹腔注射甘精胰島素，EP組為腹腔注射丙酮酸乙脂治療液，對照組為腹腔注射等體積林格液；與本組傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與EP組比較，fP<0.01；與INS組比較，hP<0.01

2.3 大鼠血漿TNF-α和HMGB1水平變化 對照組傷后各時點血漿TNF-α和HMGB1水平均明顯高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；INS+EP組、INS組、EP組傷后各時點血漿TNF-α和HMGB1水平均明顯低于對照組(P<0.01)，且INS+EP組明顯低于INS組和EP組(P<0.01)，INS組又明顯低于EP組(P<0.01)。見表3。

表3 4組嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥多器官功能不全綜合征模型大鼠血漿TNF-α和HMGB1水平變化

注：INS為胰島素，EP為丙酮酸乙酯，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，HMGB1為高遷移率族蛋白B1; INS+EP組為同時腹腔注射甘精胰島素和丙酮酸乙脂治療液，INS組為腹腔注射甘精胰島素，EP組為腹腔注射丙酮酸乙脂治療液，對照組為腹腔注射等體積林格液；與本組傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與EP組比較，fP<0.01；與INS組比較，hP<0.01

2.4 大鼠血漿MDA和TAC水平變化 對照組傷后各時點血漿MDA含量明顯高于傷前(P<0.01)，TAC明顯低于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；INS+EP組、INS組、EP組傷后各時點血漿MDA含量均明顯低于對照組(P<0.01)，且INS+EP組明顯低于INS組和EP組(P<0.01)；INS+EP組、INS組、EP組傷后各時點血漿TAC水平均明顯高于對照組(P<0.01)，且INS+EP組明顯高于INS組和EP組(P<0.01)；INS組傷后各時點血漿MDA含量均明顯高于EP組(P<0.01)，TAC水平卻明顯低于EP組(P<0.01)。見表4。

表4 4組嚴重創(chuàng)傷內毒素血癥多器官功能不全綜合征模型大鼠血漿MDA和TAC水平變化

注：INS為胰島素，EP為丙酮酸乙酯,MDA為丙二醛，TAC為總抗氧化能力; INS+EP組為同時腹腔注射甘精胰島素和丙酮酸乙脂治療液，INS組為腹腔注射甘精胰島素，EP組為腹腔注射丙酮酸乙脂治療液，對照組為腹腔注射等體積林格液；與本組傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與EP組比較，fP<0.01；與INS組比較，hP<0.01

3 討論

MODS患者器官功能尚未衰竭，早期發(fā)現(xiàn)和干預可得到改善[9]。本研究結果顯示，嚴重燙傷內毒素血癥MODS大鼠肝功能指標ALT、腎功能指標Cr、心肌酶譜指標CK-MB和血糖均明顯高于傷前，并持續(xù)到傷后7 d，提示創(chuàng)傷MODS動物模型復制成功。健康大鼠生命力與人類不同，MODS患者可能有其他基礎疾病或本身處于亞健康水平，這可能是本研究實驗MODS動物模型病死率僅為20%的原因。

本研究結果顯示，INS組、EP組、INS+EP組傷后各時點肝功能、腎功能、心肌酶譜指標和血糖等均明顯低于對照組，提示INS和EP治療均可以改善創(chuàng)傷后MODS大鼠相關器官功能，且聯(lián)合治療效果優(yōu)于單獨治療，但各治療組傷后器官功能指標均沒有完全恢復到正常水平，說明INS和EP只是治療創(chuàng)傷后MODS的手段之一，創(chuàng)傷后MODS需綜合治療，而不是單一治療。

胰島素是促進機體葡萄糖有效利用和降低高血糖的體內唯一激素。嚴重創(chuàng)傷后內毒素血癥誘發(fā)過度炎癥反應和氧化應激，導致胰島B細胞功能障礙和胰島素抵抗造成機體高血糖促進MODS發(fā)生與發(fā)展，胰島B細胞功能不全可作為MODS重要組成部分。創(chuàng)傷后感染炎癥應激、氧化應激、高血糖應激和MODS互為因果，互相促進MODS發(fā)生與發(fā)展[10-11]。

嚴重燒傷后早期TNF-α升高促進MODS發(fā)生與發(fā)展[12]。HMGB1是一種存在于真核細胞，可與染色體結合的非組蛋白類蛋白質，HMGB1可分泌到細胞外與TNF-α相互誘導，參與機體的過度炎癥反應，并在膿毒血癥和彌漫性血管內凝血(DIC)發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用[13-15]。氧化應激指機體氧自由基生成過多，機體抗氧化能力下降，造成機體組織細胞膜被氧化損傷的病理狀態(tài)。MDA為組織細胞膜多不飽和脂肪酸被氧化的降解產物，血漿MDA水平可作為間接反映機體氧自由基損害的指標。TAC是測定機體內還原性物質含量的指標，體內還原性物質含量越高，抗氧化能力就越強。MDA和TAC可作為評估機體氧化應激的相關指標[16-17]。本研究結果顯示，嚴重燙傷MODS大鼠傷后不同時點血漿TNF-α，HMGB1和MDA均明顯高于傷前，TAC明顯低于傷前，提示嚴重燙傷MODS大鼠同時存在炎癥反應和氧化應激狀態(tài)。

有文獻報道，胰島素治療可有效控制高血糖，明顯降低嚴重創(chuàng)傷危重患者外周血TNF-α和HMGB1等炎癥因子水平，抑制外周血單個核細胞核轉錄因子κB(NF-κB)基因表達，從而降低多種炎癥細胞因子的水平，改善MODS患者的預后[18-23]。本研究結果表明，胰島素治療控制高血糖可明顯降低嚴重燙傷MODS大鼠TNF-α和HMGB1水平，同時降低血漿MDA水平，提示胰島素具有抗炎和抗氧化作用，其抗氧化機制不甚清楚，可能是通過抗炎效果的間接作用[24-26]。EP是一種還原劑，溶解在林格液中穩(wěn)定性好、無毒性。有文獻報道，EP不僅具有抗氧化作用，也具有抗炎效果[27-28]。其抗氧化作用機制與丙酮酸分子上存在還原性酮基有關，還原性酮基可清除細胞內活性氧自由分子,而不需要酶的催化。有文獻報道，EP可改善膿毒血癥大鼠腸道屏障功能損害，并可調節(jié)膿毒血癥小鼠炎癥細胞因子和抗炎細胞因子的表達[29-31]。本研究結果表明，EP可明顯降低嚴重燙傷MODS大鼠血漿MDA含量、提高血漿TAC水平，同時降低血漿TNF-α和HMGB1水平，提示EP同時具有抗氧化和抗炎作用，也可作為防治創(chuàng)傷后MODS的輔助治療藥物。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，胰島素降低炎癥因子效果明顯優(yōu)于EP，而EP抗氧化效果明顯優(yōu)于INS，提示INS和EP在抗炎和抗氧化方面作用各有側重，INS和EP聯(lián)合治療降低嚴重燙傷MODS大鼠炎癥因子及抗氧化效果明顯優(yōu)于二者單獨應用，為臨床防治創(chuàng)傷后MODS提供了新思路。

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An Experimental Study on Insulin Combined with Ethyl Pyruvate in Treatment of MODS Rats with Inflammatory Response and Oxidative Stress after Severe Burns

CHEN Rong-jian1a, WANG Zhan-ke1b， ZHANG Xiao-yun2, WANG Jian-dong3, ZHU Zhong-zhen1c, XIONG Yuan-yuan1b, LAN Xiao-peng4， WANG Shi-liang5

(a. Department of General Surgery, b. Department of Clinical Laboratory, c. Department of Infection Control and Management, 1. 94 Hospital of PLA, Nanchang 330002， China; 2. Department of Clinical Laboratory, 184 Hospital of PLA, Yingtan, Jiangxi 335000, China; 3. Department of Pathology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command, Nanjing 210002, China; 4. Department of Clinical Laboratory， Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command, Fuzhou 350100, China; 5. Institute of Burns of PLA, the First Affiliated Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

Objective To observe the effect of Insulin (INS) combined with Ethyl Pyruvate (EP) in treatment of multiorgan dysfunction syndrome (MODS) rats with inflammatory response and oxidative stress after severe burns. Methods A total of 80 MODS rats with degree III burns over 30% of body surface area were randomly divided into INS treatment group (n=20), EP treatment group (n=20), INS+EP group (n=20) and control group (n=20). The INS, EP, INS+EP and control groups were respectively given peritoneal injection with INS [2.0 U/(kg·d)], EP [40 mg/(kg·d)], INS+EP [2.0 U/(kg·d)+40 mg/(kg·d)] and same volume of Ringer Solution. The values of alanine transarninase (ALT), MB isoenzyme of creatine kinase (CK-MB), creatinine (Cr) of blood glucose and concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α), high mobility group protein-1 (HMGB1), malondialdehyde (MDA) and total anti-oxidant capability (TAC) of blood in all groups were detected and compared before the injury and on 1st, 3rd, 5thand 7thd after the injury. Results The levels of ALT, CK-MB and Cr of blood glucose, and TNF-α, HMGB1, and MDA levels of blood in INS, EP and INS + EP groups at different time points were significantly lower (P<0.01), while TAC levels were significantly higher than those in the control group (P<0.01). The levels of ALT, CK-MB and Cr of blood glucose, and TNF-α, HMGB1 and MDA of blood at different time points in INS + EP group after burns were significantly lower (P<0.01), while the TAC levels were significantly higher than those in INS and EP groups (P<0.01). The levels of blood glucose at different time points in INS + EP and INS groups after burns were significantly lower than those in EP group (P<0.01). There were no significant differences in levels of blood glucose at different time points in INS + EP and INS groups after burns (P>0.05). The levels of TNF-α, HMGB1 and TAC were significantly lower (P<0.01), and the MDA levels were significantly higher at different time points in INS group after burns than those in EP group (P<0.01). Conclusion Insulin and Ethyl Pyruvate can effectively weaken the inflammatory response and oxidative stress of MODS rats after severe burns. Both Insulin and Ethyl Pyruvate have their own advantages, and the effect of combination therapy is better than that of mono-therapy.

Burns； Multiple organ dysfunction syndrome； Insulin； Ethyl pyruvate； Inflammatory factor； Oxidative stress index； Rat, Sprague-Dawley

江西省科技支撐重點項目(2008BAI52B03)；江西省衛(wèi)生廳課題(20082044)

330002 南昌，解放軍94醫(yī)院普通外科(陳榮劍)，檢驗科(王占科、熊圓圓)，感染管理科(祝仲珍)；335000 江西 鷹潭，解放軍184醫(yī)院檢驗科(張曉云)；210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科(王建東)；350025 福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院檢驗科(蘭小鵬)；400038 重慶,第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院全軍燒傷研究所(汪仕良)

王占科，E-mail：wangzhanke@sina.com

R365;R-332

A

2095-140X(2015)08-0045-06

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.012

2015-06-16 修回時間：2015-07-05)