硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

王郁金 周永學(xué)△◇ 張 紅 閆曙光 謝 培 滿思藝 成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610072)

·實(shí)驗(yàn)研究·

硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

王郁金▲周永學(xué)△▲◇張 紅▲閆曙光▲謝 培▲滿思藝▲成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610072)

目的：探討硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì) SP、NO、5-HT、VIP表達(dá)的影響。方法：成年SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、硝菔通結(jié)方高、中、低劑量組，每組各10只。采用復(fù)方地芬諾酯灌胃建立SD大鼠功能性便秘模型，造模成功后治療組給予不同劑量硝菔通結(jié)方灌胃。觀察各組大鼠一般表現(xiàn)，首粒黑便排出時(shí)間，Elisa檢測(cè)大鼠血清中SP、NO、 5-HT，Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中VIP mRNA的水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠糞便量少,首粒黑便排出時(shí)間明顯延長(zhǎng)；血清中SP水平明顯降低，NO、5-HT水平明顯升高；結(jié)腸組織中VIP mRNA水平降低。與模型組比較，硝菔通結(jié)方各劑量組大鼠糞便量增加，首粒黑便時(shí)間縮短；血清中SP水平升高，NO、5-HT水平降低；結(jié)腸組織中VIP mRNA水平升高。大劑量組變化最為明顯。結(jié)論：大鼠便秘的發(fā)生可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)異常表達(dá)有關(guān)，硝菔通結(jié)方治療功能性便秘的機(jī)制可能是通過改變相關(guān)腸神經(jīng)遞質(zhì)SP、NO、5-HP、VIP的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

功能性便秘是常見的胃腸疾病，其發(fā)病率高，危害面廣，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。便秘患者大多自行購買刺激性瀉藥,長(zhǎng)期服用造成“瀉劑結(jié)腸”。硝菔通結(jié)方是周永學(xué)教授前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究的治療便秘的主方，且其不含蒽醌類成分。因此我們進(jìn)一步研究該方對(duì)功能性便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)的影響，明確其治療功能性便秘的作用機(jī)制，為藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠， 50只，體重200g左右，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(陜)2012-003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 硝菔通結(jié)方(肉蓯蓉、當(dāng)歸各15g,芒硝30g,鮮萊菔1000g)；水煎并濃縮。復(fù)方地芬諾酯片：江蘇常州康普藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 大鼠SP、NO、5-HT Elisa檢測(cè)試劑盒：上海西唐生物技術(shù)有限公司，EasyPure RNA Kit、 CDNA合成試劑盒、Q-PCR試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司，VIP引物的設(shè)計(jì)與合成：南京金斯瑞生物科技有限公司。酶標(biāo)儀：ELX808，美國(guó)Bio-Tek公司，離心機(jī):KDC-40低速離心機(jī)，PCR儀EDC-810型高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī))：XHF-D，寧波新芝生物科技股份有限公司，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 動(dòng)物分組 SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、功能性便秘模型組、硝菔通結(jié)方高(380g/kg)、中(190g/kg)、低(95g/kg)劑量組，每組10只。

2.2 動(dòng)物模型的制備 根據(jù)文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的方法和劑量，以復(fù)方地芬諾酯灌胃10mL/kg體積(15mg/kgmL濃度)，觀察大鼠的一般狀態(tài)，大鼠進(jìn)食量，大便量和大便質(zhì)地確定模型制備成功。

2.3 動(dòng)物給藥 大鼠造模成功后，治療組以制備好的硝菔通結(jié)方水煎液進(jìn)行灌胃?？瞻捉M以予同體積生理鹽水；共給藥4周。

2.4 檢測(cè)指標(biāo) 一般行為學(xué):觀察每日觀察動(dòng)物一般行為表現(xiàn)及排便情況。

首粒黑便觀測(cè)采用活性炭灌胃法測(cè)定首粒黑便時(shí)間，觀察腸道傳輸功能，硝菔通結(jié)方治療后，每組隨機(jī)挑取5只大鼠，單只放于大鼠代謝籠內(nèi)，以活性炭灌灌胃，記錄首粒黑便排出時(shí)間。

血清SP、 NO、 5-HT檢測(cè) 給藥結(jié)束后，動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血取血，離心，分離血清，檢測(cè)大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的含量。給藥后，取各組大鼠相應(yīng)部位1cm結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗，放入有RNA保護(hù)液的無菌EP管中，迅速保存至-80℃冰箱備用。組織勻漿，按RNA提取試劑盒提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，測(cè)cDNA濃度。Q-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)，引物序列如下：上游引物：5′-AAGCTCCAGGTTGGAAGTTGAG-3′，VIP下游引物：5′-GCTGCCGTGTTACATAAAGCAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為210bp；β-actin上游引物：5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，β-actin下游引物：5′-TGTATGCCTCTGGTCGT-ACCAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為592bp。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1便量首粒黑便排出時(shí)間的影響 與空白組比較，模型組大鼠排便量減少，首次黑現(xiàn)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；與模型組比較，硝菔通結(jié)方各劑量組大鼠排便量增加，首粒黑現(xiàn)時(shí)間均明顯縮短(P<0.01)，見表1。

表1 首粒黑便排除時(shí)間的影響

組 別劑量(g/kg)糞便量(g)首粒黑便排除時(shí)間(min)空白-7.91±1.18177.66±21.50模型-5.13±0.69△287.69±25.99△硝菔通結(jié)方3808.22±1.99▲169.45±23.99▲ 1907.42±1.32▲184.24±13.43▲ 956.08±1.40206.74±38.49▲

注：與空白組比較△P<0.01；與模型組比較▲P<0.01。

3.2 大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中SP含量低于空白組(P<0.01)；NO含量高于空白組(P<0.01)； 5-HT含量高于空白組(P<0.05)。與模型組比較，硝菔通結(jié)方大、中劑量組大鼠血清中SP水平明顯升高(P<0.01)，小劑量組無顯著性差異；大劑量組NO水平明顯降低 (P<0.01)，中劑量組NO含量也降低(P<0.05)，而小劑量組無顯著性差異；大劑量組大鼠的5-HT水平明顯降低 (P<0.01)，而中小劑量組無顯著性差異，見表2。

3.3大鼠結(jié)腸組織中VIP mRNA水平 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中VIP mRNA表達(dá)明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，硝菔通結(jié)大、中劑量組大鼠結(jié)腸組織中VIP mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，硝菔通結(jié)小劑量組也有升高(P<0.05)，見表3。

表2 硝菔通結(jié)方對(duì)大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的影響

注：與空白組比較△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較◇P<0.01。

表3 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠結(jié)腸

注：與空白組比較△P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，◇P<0.01。

4 討 論 功能性便秘多發(fā)于體質(zhì)衰弱及老年人群。周永學(xué)教授取治療腎虛便秘的濟(jì)川煎組方中的肉蓯蓉、當(dāng)歸，結(jié)合軟堅(jiān)散結(jié)、理氣通便，確立了硝菔通結(jié)方(肉蓯蓉、當(dāng)歸、芒硝、萊菔)溫腎益精養(yǎng)血，軟堅(jiān)潤(rùn)下通便，治療功能性便秘療效確切，且不含蒽醌類成份。

腸神經(jīng)系統(tǒng)可獨(dú)立調(diào)節(jié)腸道功能,其在功能性便秘中的改變具有重要意義。SP、5-HT、NO和VIP是調(diào)節(jié)腸道功能的重要腸神經(jīng)遞質(zhì)，它們可以通過抑制或興奮作用來調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。SP能抑制胃腸道黏膜分泌,刺激腸道運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，便秘大鼠腸肌間神經(jīng)叢SP含量明顯下降,同時(shí)伴有腸道運(yùn)動(dòng)功能下降[1]。Yik 等觀察兒童慢傳輸性便秘患者時(shí)也發(fā)現(xiàn) SP 明顯降低，且女性降低發(fā)生率( 40%) 高于男性( 20%)[2]。NO與腸動(dòng)力有密切關(guān)系，可以調(diào)節(jié)腸黏膜血流和分泌功能，并可使腸道平滑肌直接松弛，從而影響腸道的排便功能。5-HT可以介導(dǎo)腸神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸道調(diào)節(jié)， 5-HT能使腸道蠕動(dòng)加快，腸道分泌增多，并有改善腸壁血液循環(huán)的作用。近年來大量人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了5-HT與腸道動(dòng)力及感覺異常有[3-5]。VIP是肽能神經(jīng)遞質(zhì),也是ENS中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一,具有使胃腸道平滑肌松弛和舒血管作用[6,7]。腸道組織中VIP能神經(jīng)元及其神經(jīng)纖維分布的減少可以導(dǎo)致腸道的分泌功能減弱，分泌的腸液量減少, 進(jìn)一步使腸道推動(dòng)作用減弱，引起便秘。

本研究證明功能性便秘大鼠血清中SP水平明顯降低，NO、5-HT水平明顯升高，結(jié)腸組織中VIP mRNA水平明顯降低。硝菔通結(jié)方能改善功能性便秘大鼠的便秘癥狀，同時(shí)能提高功能性便秘大鼠血清中SP水平，降低NO、5-HT水平，提高結(jié)腸組織中VIP mRNA的表達(dá)水平，尤以大劑量組效果最為明顯。硝菔通結(jié)方治療功能性便秘的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)場(chǎng)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，且有一定劑量依賴性。

[1] 王 梅,呂 賓,范一宏,等.刺激性瀉劑對(duì)大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢超微結(jié)構(gòu)的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2005,25(4):434-436.

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(收稿2014- 09-09；修回2014-11-02)

Effect of Xiaofu Tongjie decoction on intestinal neurotransmitters of rats with functional constipation

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu 610072)

Wang Yujin Zhou Yongxue Zhang Hong et al

Objective: To explore the effect of Xiaofu Tongjie decoction on expression of intestinal neurotransmitters SP, NO, 5-HT, VIP of rats with functional constipation .Methods: Adult male SD 50 rats were randomly divided into control group, model group, Xiaofu Tongjie decoction high, medium, low dose group with 10 rats in each group. Using compound diphenoxylate tablets orally molding functional constipation model, after the success of modeling, the treatment group was given Xiaofu Tongjie prescripition gavaged. Observed the rats general performance, the time of first black stool. Detected of rats’ SP, NO, 5-HT level in serum by Elisa, detected of VIP mRNA level in colon tissue by Q-PCR. Results: Compared with the control group, the model group rats feces quantity was little, the time of first black stool significantly prolonged; serum SP levels decreased significantly, NO, 5-HT level increased significantly; VIP mRNA level in colon tissue decreased. Compared with the model group, Xiaofu Tongjie decoction each dose group rats increased fecal,the time of first black stool is shortened; the SP, NO, 5-HT levels in serum are decreased; VIP mRNA level in colon tissue increased. The changes of high dose group was most obviously. Conclusion: It is probably that the occurrence of functional constipation in rats was related to abnormal expression of neurotransmitters. The mechanism of Xiaofu Tongjie the rpesctipti in the treatment of functional constipation may be through changes the expression of neurotransmitters in enteric nervous system, SP, NO, 5-HP, VIP.

Constipation, function/integrated Chinese traditional and western medicine therapy @Xiaofu Tongjie decoction Animal experimentation Rats

*國(guó)家自然科學(xué)基金(81273663);國(guó)家課題重大專項(xiàng)(2012ZX09103201-037)

便秘, 功能性/中醫(yī)藥療法 @硝菔通結(jié)方 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R271.11

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.058

△通訊作者

▲陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

◇陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室(咸陽 712046)