黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

△通訊作者

黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕△

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

目的：建立黃連解毒湯水煎液高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜，為黃連解毒湯的質(zhì)控提供依據(jù)。方法：采用HPLC-DAD檢測(cè)器，XDB-C18PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水，流速為1 mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm、240nm，梯度洗脫黃連解毒湯樣品。結(jié)果：建立了含有30個(gè)色譜峰的高效液相色譜圖，均得到了良好的基線分離；同時(shí)對(duì)鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷等指標(biāo)成分進(jìn)行了含量檢測(cè)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快捷、精密度高、重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定，可用于黃連解毒湯的質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)收集了10個(gè)批次不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)時(shí)間、不同廠家的黃連、黃芩、黃柏、梔子等藥材，按處方比例交叉組方后通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)建立了黃連解毒湯水煎液的HPLC指紋圖譜，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行了考察，同時(shí)測(cè)定其中三大類(黃酮類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類)7種成分(鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷)的含量，為該方的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料 儀器：美國(guó)惠普公司的Agilent 1100高效液相色譜儀、上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠的XW-80A旋渦混合器、上海必能超聲儀器公司的SB2200 超聲儀、上海醫(yī)用分析儀器廠的Sartorius BS110S精密電子天平、TGL-16G 臺(tái)式高速離心機(jī)、鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司的SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠的XMT-152電熱恒溫干燥箱。

試劑：HPLC甲醇(德國(guó)默克公司)、HPLC乙腈(德國(guó)默克公司)、磷酸(上海聯(lián)合化工廠)、所用水均為純凈水，通過(guò)Milli-Q 水處理系統(tǒng)(Millipore, Bedford, MA, USA)進(jìn)行處理。

對(duì)照品：梔子苷(批號(hào)110749-200714)，鹽酸巴馬汀(批號(hào)110732-200907)，鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-200208)，黃芩苷(批號(hào)110715-200413)，黃芩素(批號(hào)111595-0200905)等均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度>99%)。鹽酸藥根堿(批號(hào)110733-201108)，漢黃芩素(批號(hào)111514-200403)等購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所(純度>99%)。

藥材：按處方量交叉組合不同批次的黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材，組成10個(gè)批次的黃連解毒湯(見(jiàn)表1)。

2 方法與結(jié)果 色譜條件：采用XDB-C18 PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；通過(guò)流動(dòng)相A為乙腈和流動(dòng)相B為0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，具體條件如圖1所示；流速為1 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm(梔子苷檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm)；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)時(shí)間：90 min。

圖1 黃連解毒湯色譜條件

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿4 mg、鹽酸藥根堿0.6 mg、鹽酸巴馬汀0.8 mg、黃芩苷4.7 mg、黃芩素0.65 mg、漢黃芩素0.65 mg、梔子苷7.2 mg，將所稱取的藥品分別置于5 mL量瓶，應(yīng)用甲醇定容，并進(jìn)行不同濃度的稀釋，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)即為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：對(duì)組合成的10個(gè)批次黃連解毒湯分別加10倍量水進(jìn)行處理，冷浸30min，武火加熱至沸后文火保持微沸20min，注意趁熱過(guò)濾，再加水8倍量，武火加熱至沸后轉(zhuǎn)為文火微沸20min，并趁熱過(guò)濾，將2次濾液進(jìn)行合并。用10mL的量瓶分裝合煎液，每瓶各2mL，再加甲醇約至10mL，超聲提取20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)充溶劑至刻度，搖勻，靜置過(guò)夜后，取上清液，進(jìn)行離心(10,000 轉(zhuǎn)/min)10 min，再經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

表1 藥材產(chǎn)地及購(gòu)買(mǎi)廠家來(lái)源

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：將對(duì)照品溶液精密吸取注入色譜儀，進(jìn)樣量為5 μL，測(cè)定峰面積按2.1項(xiàng)方法，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度及加樣回收率試驗(yàn)：按高、中、低劑量將同一份黃連解毒湯(JQZJ3)分別加入對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下的處理得供試品溶液，連續(xù)測(cè)定3次分別于1d內(nèi)完成，以5μL為每次進(jìn)樣量，記錄峰面積，計(jì)算回收率、日間及日內(nèi)精密度。分別測(cè)定各對(duì)照品的最低檢測(cè)限(LOD)及最低定量限(LOQ)于信噪比(S/N)為3、10時(shí)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份黃連解毒湯的供試品溶液，在0,2,4,24,48 h分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD，考察色譜條件的穩(wěn)定性。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：選取黃連解毒湯合煎液2 mL，按2.3項(xiàng)下藥液處理方法平行處理3份樣品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣5 μL，考察方法重現(xiàn)性。

供試品測(cè)定：按照2.1.項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣3 μL，檢測(cè)分析，記錄90 min色譜圖，每個(gè)供試品溶液進(jìn)樣3次，建立黃連解毒湯合煎液的HPLC指紋圖譜。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：參照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用回歸分析的方法計(jì)算樣品指標(biāo)成分的含量。

以參照物對(duì)應(yīng)的色譜峰(s)的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1，各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中對(duì)照峰的保留時(shí)間的比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RRT)，各指紋峰峰面積與同一圖譜中對(duì)照峰的峰面積的比值為各指紋峰的相對(duì)峰面積(RPA)，計(jì)算各批藥材指紋圖譜的共有峰的RRT和RPA。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)，疊加供試品的指紋圖譜。對(duì)各批次藥材及煎液運(yùn)用夾角余弦法計(jì)算相似度。根據(jù)幾何學(xué)多維空間的向量夾角制定向量余弦法，把兩個(gè)指紋當(dāng)作兩個(gè)向量，計(jì)算夾角余弦相似度，進(jìn)行相似度分析。

圖譜情況：從供試品圖譜可以看出，在現(xiàn)有色譜條件下，7個(gè)指標(biāo)成分在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下均得到良好的基線分離(圖2)。而梔子苷在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下峰型更清晰可見(jiàn)，因此，這里將黃連解毒湯在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜單獨(dú)列開(kāi)，以更好的觀察指標(biāo)成分梔子苷(圖3)。

檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)一共得到30個(gè)共有峰，其中3為梔子苷，15為鹽酸藥根堿，17為黃芩苷，18為鹽酸巴馬汀，19為鹽酸小檗堿，27為黃芩素，28為漢黃芩素(圖2)。

(3:梔子苷,15:鹽酸藥根堿,17:黃芩苷,18:鹽酸巴馬汀,19:鹽酸小檗堿,27:黃芩素,28:漢黃芩素)

圖3 黃連解毒湯傳統(tǒng)煎煮色譜圖 (240 nm)(1:梔子苷)

方法學(xué)結(jié)果表明：各指標(biāo)成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)，均有良好的相關(guān)系數(shù)(>0.9994)，線性關(guān)系良好(表2)；除了黃芩素日間RSD=10.32%外，各指標(biāo)成分的日內(nèi)及日間RSD均<2.50%，肯定了本方法的精密度；定量限及最低檢測(cè)限均能滿足樣品測(cè)定的要求；梔子苷回收率為92.47%～106.86%，鹽酸小檗堿回收率為110.97%～115.14%，鹽酸藥根堿回收率為基本為112.26%～116.26%，鹽酸巴馬汀回收率為111.97%～112.65%，黃芩苷回收率為105.46%～107.69%，黃芩素回收率為87.32%～101.09%，漢黃芩素回收率為98.43%～110.14%，表明回收率良好。供試品主要指標(biāo)的成分保留時(shí)間控制在：RSD為0.05%～0.33%，相對(duì)峰面積RSD為0.18%～1.72%，由此可知該試驗(yàn)方法在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。主要指標(biāo)成分相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.8%，相對(duì)峰面積的RSD在1.09%～4.83%之間，表明該方法重現(xiàn)性良好。總言之，現(xiàn)有色譜法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率良好，可以進(jìn)行下一步分析。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

對(duì)照品回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍(μg)梔子苷y=1349.21x-20.740.9999660.11～7.20鹽酸巴馬汀y=1429.77x+2.550.9999330.16～1.12鹽酸藥根堿y=1485.35x+13.330.9996990.12～0.60鹽酸小檗堿y=1215.79x+18.850.9997680.12～3.20黃芩素y=2810.60x-31.250.9997130.07～0.78漢黃芩素y=4144.87x-31.020.9998530.02～0.65黃芩苷y=2445.25x-67.110.9994320.48～4.70

指標(biāo)成分含量結(jié)果：對(duì)黃連解毒湯水煎液不同批次的成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明(表3)：不同批次的指標(biāo)成分含量具有一定差異，RSD在8.91%～45.38%之間，有的成分含量甚至可以相差數(shù)倍，如ZW17與ZW18中的黃芩苷、ZW18與ZW20中的黃芩素。

表3 不同批次黃連解毒湯水煎液指標(biāo)成分含量(mg/g)

相似度結(jié)果：在黃連解毒湯水煎液圖譜中，黃芩苷峰在10批合煎液中基本一致，且黃芩苷有合理的洗脫時(shí)間和已知的藥理活性，因此將黃芩苷選為參照峰。以此為對(duì)照計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，但是相對(duì)峰面積的RSD較大，說(shuō)明藥液各批次的保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，但各批次峰面積含量有一定差異。

3 討 論 黃連解毒湯首載于《肘后備急方》，為清熱解毒經(jīng)典名方，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗血小板、抗氧化等藥理作用[1-4]。可以單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療不穩(wěn)定型心絞痛、糖尿病、骨髓瘤、肛周膿腫以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病[6-10]。從藥物學(xué)角度來(lái)看，黃連解毒湯的理化性質(zhì)差異較大、化學(xué)成分較多、分離難度較大等，因此先前的很多研究報(bào)道都局限在整體藥效學(xué)的研究，而缺乏對(duì)其全方經(jīng)配伍組合、煎煮后的藥理變化的深入探討[11-14]。故此，本文著重研究該方煎煮后湯劑的化學(xué)特征。

目前，指紋圖譜是一種已經(jīng)應(yīng)用成熟的分析方法，既有量的測(cè)定，又有質(zhì)的特征檢測(cè)，對(duì)研究對(duì)象可作出全面、綜合地反映，較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究中，將指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)體系引入到相關(guān)研究的成果較少，本實(shí)驗(yàn)建立了黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜，并采用相似度分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，不同批次的黃連解毒湯指紋圖譜特征、指標(biāo)成分的含量存在一定差異，這說(shuō)明產(chǎn)地、采收、加工方式、存儲(chǔ)時(shí)間和方法以及煎煮過(guò)程對(duì)湯劑的質(zhì)量均存在可能的影響。然而，如何將指紋圖譜的豐富信息綜合起來(lái)來(lái)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量是本文不足之處，有待今后將各種化學(xué)信息、藥效信息綜合起來(lái)，從而更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量。

同時(shí)，從本次研究過(guò)程來(lái)看，高效液相色譜法在應(yīng)用中可以收集到藥品定性、定量的雙重信息，可以將復(fù)雜的方劑化學(xué)成分進(jìn)行個(gè)體化區(qū)分。這種點(diǎn)面結(jié)合的研究方法，是適合于中藥方劑復(fù)合型組成特點(diǎn)的。在未來(lái)的探索中，我們應(yīng)注重與方劑生產(chǎn)的實(shí)際結(jié)合，在目前中醫(yī)藥需求市場(chǎng)日益擴(kuò)大的情勢(shì)下，力圖為中醫(yī)藥現(xiàn)代化生產(chǎn)提供相應(yīng)的參考依據(jù)，使科學(xué)研究成果高效的轉(zhuǎn)化為實(shí)際生產(chǎn)的方法。

[1] 劉衛(wèi)霞,王俊平,林立紅,等. 黃連解毒湯的鎮(zhèn)痛、抗炎及體內(nèi)抗腫瘤作用[J]. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2013.15(1):53-55.

[2] 汪天明.黃連解毒湯乙酸乙酯提取物對(duì)白假絲酵母菌黏附作用的影響[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26(4):391-399.

[3] 周 靜.黃連解毒湯及其單味藥精制前后抗血小板聚集作用的研究[J]. 中成藥，2013，35(6):1312-1315.

[4] 張 揚(yáng),金 瑾,張蓮珠,等.黃連解毒湯對(duì)高脂血癥大鼠血脂及氧自由基代謝的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17(2):169-172.

[5] 費(fèi) 強(qiáng),桑文鳳,趙習(xí)德. 桂枝茯苓湯合黃連解毒湯治療不穩(wěn)定型心絞痛[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(20):286-289.

[6] 張錫濤.黃連解毒湯聯(lián)合二甲雙胍治療E型糖尿病的臨床觀察[J]. 吉林醫(yī)學(xué)，2014，35(16):3471-3473.

[7] 杜國(guó)心.黃連解毒湯聯(lián)合化療治療多發(fā)性骨髓瘤的療效分析[J]. 臨床血液學(xué)雜志，2012，25(5):306-308.

[8] 楊凌玉.黃連解毒湯配合手術(shù)治療肛周膿腫74例療效觀察[J]. 吉林醫(yī)學(xué)，2012，18(20):4058-4059.

[9] 龍建飛.黃連解毒湯有效部位對(duì)腦缺血大鼠半暗帶神經(jīng)元NeuN、Caspase-3、PARP表達(dá)的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37(2):90-98.

[10] 邵 衛(wèi). 黃連解毒湯聯(lián)合石杉?jí)A甲片治療老年性癡呆臨床觀察[J]. 湖北中醫(yī)雜志，2012，34(9):11-12.

[11] 肖學(xué)鳳. 黃連解毒湯中三種成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究,中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,5(3):13-16.

[12] 袁 立,李新中. 黃連解毒湯傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒湯劑中小檗堿的藥動(dòng)學(xué)的比較.中南藥學(xué)，2010,8(9):645-648.

[13] 竇錦明. 黃連解毒湯方藥3種方法提取液成分比較. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010,21(6):1369-1372.

[14] 宋 玨. 黃連解毒湯抗氧化作用的血清藥理學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010,16(4):118-122.

(收稿2014- 08-15；修回2014-11-25)

黃連解毒湯 @高效液相色譜法

O657.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.054