復(fù)方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷純化工藝研究*

董泰瑋 王昌利 史亞軍 陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽712046)

復(fù)方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷純化工藝研究*

董泰瑋 王昌利△史亞軍 陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽712046)

目的：篩選復(fù)方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷的純化工藝。方法：采用HPLC分析方法，以葛根素和薯蕷皂苷含量為評價指標(biāo)，分別對樹脂類型、洗脫乙醇濃度、上樣量、洗脫速度和洗脫體積影響因素進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果：優(yōu)化的最佳工藝條件為用AB-8大孔樹脂進(jìn)行純化，上樣量與樹脂比為1 mL：1g，以0.5 BV/h的速度80%乙醇洗脫，4BV可洗脫完全，葛根素回收率為96.62%，薯蕷皂苷回收率為97.79%。結(jié)論:此純化工藝參數(shù)合理，重復(fù)性好，為復(fù)方龍脈寧滴丸進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

復(fù)方龍脈寧滴丸是陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦病科陶根魚教授在長期臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上，通過基礎(chǔ)研究篩選出來的主要針對心腦血管疾病，湯劑臨床療效好，經(jīng)前期動物實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方龍脈寧滴丸具有擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)的作用[1]。該復(fù)方由葛根、穿山龍、川芎、蜂膠四味藥組成，葛根為方中君藥，其有效成分是異黃酮類化合物，有大豆苷元、大豆苷、葛根素等，葛根素改善微循環(huán)障礙，冠狀動脈擴(kuò)張劑，增加冠狀動脈血流量，減少心肌氧耗量，抑制血小板凝集[2]。方中穿山龍為佐藥，有抗炎、擴(kuò)張冠狀動脈、抗動脈硬化、調(diào)節(jié)代謝等作用，其主要活性成分為甾體皂苷，薯蕷總皂苷改善冠脈血液循環(huán)，降低動脈壓，減慢心率，增強(qiáng)心肌收縮的作用[3]。

本課題組前期對復(fù)方龍脈寧滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、純化工藝進(jìn)行研究[4-6]。但前期都是以復(fù)方提取液中葛根素為評價指標(biāo)，而對于方中其他指標(biāo)未進(jìn)行考察。因此本實(shí)驗(yàn)以葛根素和薯蕷皂苷為評價指標(biāo)，通過大孔吸附樹脂純化富集實(shí)驗(yàn)的思路，以期為進(jìn)一步研究提供合理可行的參考依據(jù)。

1儀器與試藥 1.1儀 器 日立雙泵系統(tǒng)液相色譜儀(批號：LC-7000A)；PH計(jì)(奧立龍PHS-3C)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000；AR1140 Mettler Toledo電子天平，精密度：萬分之一)；KH-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器。

1.2 試 藥 葛根素對照品(批號:110773-201012)，薯蕷皂苷對照品(批號:111707-200501)，兩種對照品均由中國藥品生物制品檢定所測定。葛根為豆科植物野葛的干燥根莖，穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷的干燥根莖，并經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室王繼濤教授鑒定。乙腈為色譜純，水為蒸餾水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果 2.1色譜條件 測定葛根素色譜條件：色譜柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；甲醇-水流動相(25:75)；檢測波長：250 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min[7]。

測定薯蕷皂苷的色譜條件：色譜柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；乙腈-水流動相(54∶46)；檢測所得波長210 nm；柱溫度：25℃；流速：1.0 mL/min[8]。

2.2 溶液的制備 對照品葛根素溶液的制備:葛根素標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取12.5 mg，用乙醇超聲溶解，定容至25 mL，混勻；將該液精密吸取1 mL置于10 mL容量瓶，用乙醇定容，濃度為0.05 mg/mL，4℃冷藏備用。對照品薯蕷皂苷溶液:薯蕷皂苷對照品精密稱取7.6 mg，用70%乙醇溶解，定容至10 mL,濃度0.76 mg/mL，4℃冷藏備用。

樣品溶液的制備:在前期實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)確定了提取工藝，取葛根300 g，川芎200 g，穿山龍200 g，以8倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，回收乙醇，濃縮至1000 mL[9]。該工藝中葛根素和薯蕷皂苷的提取率分別為4.26% 、1.38%。

2.3 方法學(xué)建立 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:葛根素對照品溶液精密吸取分別5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定其峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)，葛根素含量C(μg)為橫坐標(biāo)，回歸方程：A=107x+106，R2=0.9991，線性范圍為0. 25 μg～1. 25 μg。薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取薯蕷皂苷對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項(xiàng)所設(shè)色譜條件對峰面積進(jìn)行測定，以峰面積A為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷含量C(μg)為橫坐標(biāo),得線性方程：C=488639x+433142，R2=0.9995，線性范圍為值3.80 μg～19.00 μg。

精密度:對葛根素和薯蕷皂苷對照品進(jìn)行精密吸取，各取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次，得RSD值分別為0.78%和1.05%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性:精密吸取“2.2”項(xiàng)下稀釋后的樣品溶液10 μL，分別于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，得RSD值分別為2.56%和1.89%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

重復(fù)性:按照“2.2”項(xiàng)下配比及提取方法制備樣液，平行制取6份，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測定葛根素及薯蕷皂苷的峰面積，計(jì)算獲得RSD值分別為2.32%和2.51%，表明樣品重復(fù)性較好。

加樣回收率:精密吸取供試品溶液1 mL，各2份，分別加入等量葛根素對照品溶液與薯蕷皂苷對照品溶液，混勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，經(jīng)計(jì)算得葛根素的平均回收率為98.64%，RSD為2.71%。薯蕷皂苷的平均回收率為97.43%，RSD為0.24%。

2.4 洗脫條件的優(yōu)選 樹脂的處理:分別取適量AB-8，D101大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，裝入洗脫柱，用95%乙醇沖洗，直至流出液1 mL加4 mL蒸餾水不呈白色渾濁為止，然后用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味，備用。

樹脂類型的選擇:分別取已處理好的AB-8，D101大孔樹脂適量于兩根柱子中，各加入2BV的藥液，用10BV的70%乙醇洗脫，收集全部洗脫液，稀釋10倍后，照“2.1”項(xiàng)下各色譜條件測定峰面積，進(jìn)樣2 μL測定葛根素含量，進(jìn)樣10 μL測定薯蕷皂苷的含量，測定結(jié)果見表1[2,10-12]。由表1可知兩種樹脂無明顯差別，鑒于AB-8價格低于D101，選擇AB-8樹脂。

表1 大孔樹脂類型的選擇(mg)

樹脂類型葛根素洗脫量薯蕷皂苷洗脫量AB-82.03304.2315D1011.99314.2203

洗脫濃度的選擇:取2g處理好的樹脂各7份，加入5 mL樣品溶液充分吸附振蕩，放置24 h。用清水洗去多余藥液，加入30%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇各10 mL，放置12 h，制樣。照“2.1”項(xiàng)下各色譜條件測定峰面積，計(jì)算洗脫量，結(jié)果見表2。由表2可知葛根素的最佳洗脫濃度為80%的乙醇，薯蕷皂苷則為95%的乙醇，考慮到葛根為君藥，且80%與95%乙醇洗脫時薯蕷皂苷差別不大，所以選擇80%乙醇作為洗脫劑。

表2 不同醇濃度洗脫量

測定指標(biāo)30%50%60%70%80%95%葛根素0.70230.29093.60114.44824.91760.0531薯蕷皂苷0.94570.92500.96330.97000.98200.9912

藥材上樣量的確定:分別取1g、2g、3g、4g、5g、6g樹脂各加入5 mL藥液振蕩24 h，靜置，取上清液，稀釋10倍，照“2.1”項(xiàng)下各色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，計(jì)算不同樹脂中各指標(biāo)的吸附率，確定上樣藥液和樹脂比，結(jié)果見表3。由表3可知5 mL藥液葛根素需要4 g樹脂吸收，而薯蕷皂苷需5 g樹脂，故上樣量與藥材比為1 mL：1g。

表3 上樣量的選擇

樹脂量(g)葛根素吸附率(%)薯蕷皂苷吸附率(%)175.7540.61295.7263.45310082.80410092.5451001006100100

藥材洗脫速度的確定:本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)吸附-動態(tài)解析的方法，按1g∶1 mL的樹脂與藥材比例上樣后，分別以0.5 BV/h、1.0 BV/h、2.0 BV/h的速度洗脫，收6BV的洗脫液，照“2.1”項(xiàng)下各色譜條件測定峰面積，計(jì)算葛根素和薯蕷皂苷的洗脫率，結(jié)果見表4。由表4可知洗脫速度對葛根素的影響不大，對薯蕷皂苷的影響顯著，故選擇0.5 BV/h的洗脫速度。

表4 洗脫速度的選擇

洗脫速度(BV/h)葛根素洗脫率(%)薯蕷皂苷洗脫率(%)0.588.9796.42176.7583.56257.9464.26

最佳洗脫量的選擇:80%乙醇以0.5 BV/h的速度對過量飽和的AB-8樹脂進(jìn)行洗脫，1BV收集一份濾液，共收集8份，照“2.1”項(xiàng)下各色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷的峰面積，計(jì)算累積洗脫率，結(jié)果見表5。由表5可知4BV可洗脫完全，因此最佳洗脫量為4BV。

表5 洗脫體積的選擇(%)

序號葛根素累積洗脫率薯蕷皂苷累積洗脫率190.8657.79299.6179.643100.1593.354100100.785100100610010071001008100100

3 討 論 本實(shí)驗(yàn)針對處方中葛根素和薯蕷皂苷進(jìn)行富集純化，以便簡化工藝，為復(fù)方龍脈滴丸的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

大孔樹脂的純化原理是吸附和分子篩作用綜合的結(jié)果,吸附作用是由于范德華力或氫鍵的作用讓物質(zhì)與樹脂緊密結(jié)合；而分子篩作用則是由于樹脂間的多孔結(jié)構(gòu)減弱了物質(zhì)之間的吸附力,使得有機(jī)溶劑易洗脫有效成分。本實(shí)驗(yàn)葛根素的最佳洗脫濃度為80%的乙醇，薯蕷皂苷則為95%的乙醇，葛根為君藥，且80%與95%乙醇洗脫時薯蕷皂苷差別不大，所以選擇80%乙醇作為洗脫劑。

適宜的上樣液量是富集純化目標(biāo)成分的重要因素,既能防止有效成分的流失, 又能保證大孔樹脂不浪費(fèi)。本研究固定藥液體積依次增加樹脂用量來考察上樣量，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3可得上樣量與樹脂比值為1 mL∶1g時，兩種成分吸附均較好。洗脫速率對于成分的遷移及分離具有重要影響，太快時成分很難達(dá)到理想的分離，過慢則易形成死吸附。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)洗脫速度對葛根素的影響不大，而隨著洗脫速率的逐漸增大，薯蕷皂苷的洗脫率顯著減小，故選擇0.5 BV/h的洗脫速度。合適的洗脫劑用量既可以對目標(biāo)成分達(dá)到富集作用，又可以大量減少洗脫劑用量，以減少成本。由表5可知4BV可洗脫完全，若繼續(xù)洗脫，不但會增加實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度，而且會浪費(fèi)很多溶劑，因此選擇4BV進(jìn)行洗脫。

綜合以上影響因素，本試驗(yàn)通過靜態(tài)吸附、動態(tài)解吸的方法,最終選擇以AB-8樹脂為復(fù)方龍脈寧滴丸的純化樹脂 ，80%乙醇以0.5 BV/h的速度上樣量與樹脂比為1 mL：1g進(jìn)行洗脫，4BV可洗脫完全，此工藝條件下葛根素回收率為96.62%，薯蕷皂苷回收率為97.79%。該方法簡單易行，重現(xiàn)性好，對生產(chǎn)和臨床具有較好的參考意義。

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(收稿2014- 09-12；修回2014-10-15)

*陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2012KTCQ03-13);國家自 然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373944);陜西省中藥制藥重點(diǎn)學(xué)科資助

葛根素 薯蕷皂苷 @復(fù)方龍脈寧滴丸

R283

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.051

△通訊作者