蘿卜硫素對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘能力的影響

西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(西安710003)

王麗萍

蘿卜硫素對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘能力的影響

西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(西安710003)

王麗萍

目的：研究蘿卜硫素對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘能力的影響。方法：選擇乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系K1及濾泡狀甲狀腺癌細(xì)胞系FTC133進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同濃度蘿卜硫素處理24h，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS) mRNA的表達(dá)；通過(guò)γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞攝碘能力。結(jié)果：反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)結(jié)果表明，蘿卜硫素可以上調(diào)NIS基因的表達(dá)，并呈濃度依賴性；γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果表明，蘿卜硫素可以提高分化型甲狀腺癌的攝碘能力。 結(jié)論：蘿卜硫素為放射性碘治療分化型甲狀腺癌提供了新的思路。

在甲狀腺癌的臨床治療中，化療藥物對(duì)其不敏感，而對(duì)于分化型甲狀腺癌，放射性碘治療療效確切。因此，如何提高分化型甲狀腺癌細(xì)胞的攝碘率成為研究熱點(diǎn)。鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Sodium/Iodide Symporter，NIS) 是一種跨膜糖蛋白，主要位于甲狀腺濾泡細(xì)胞的基底膜上，是甲狀腺濾泡細(xì)胞攝碘的分子基礎(chǔ)。本研究以人分化型甲狀腺癌細(xì)胞系K1、FTC133為研究對(duì)象，了解蘿卜硫素對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘率的影響。

材料和方法

1 材 料

1.1 細(xì)胞株：人甲狀腺癌細(xì)胞系FTC133, K1由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 試劑：胎牛血清(FBS)：購(gòu)自HyClone, Lot: NWCO389。非必需氨基酸：購(gòu)自Gibco, Lot:1171639。丙酮酸鈉：購(gòu)自Gibco, Lot:1228076。中性蛋白酶：Gibco分裝。D-MEM/F-12，RPMI Medium 1640：均購(gòu)自Gibco, Lot:1294292、1250959。使用前每500 ml D-MEM/F-12培養(yǎng)基分別加入10%的FBS；每500 ml RPMI Medium 1640培養(yǎng)基分別加入10%的FBS，5 ml非必需氨基酸，5 ml丙酮酸鈉，配置成完全培養(yǎng)基，過(guò)濾除菌，4℃保存。0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液：購(gòu)自Gibco, Lot:1123262。二甲亞砜(DMSO)：購(gòu)自MP Biomedicals，Lot:M4300，常溫避光保存。蘿卜硫素(L-Sulforaphane)：購(gòu)自Cayman。

1.3 儀器：CO2細(xì)胞孵育箱(購(gòu)自Thermo Scientific)，倒置顯微鏡XD-202(購(gòu)自江南光學(xué)儀器廠)，CFX96熒光定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Biorad公司)，γ計(jì)數(shù)儀(購(gòu)自上海上立檢測(cè)儀器廠)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后待懸浮細(xì)胞貼壁，加入不同濃度蘿卜硫素(5μM、10μM、20μM、40μM)，作用24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)，RT-qPCR通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)液中 SYBR Green I 的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。SYBR?Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，所以可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBR?Green I熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。NIS上游引物序列為5'-CCTGCTAACGACTCCAGCA-3'，下游引物序列為5'-CCAGGGCACCGTAATAGAGA-3'，18s作為內(nèi)參，上游引物序列為5'-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3'，下游引物序列為5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'。

2.3 計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞攝碘能力：蘿卜硫素作用24 h后用小試管收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每管的細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×105個(gè)。離心后棄上清，預(yù)冷PBS清洗2次。向每個(gè)試管加入l ml含125I的HBSS溶液(含37kBq125I)，置于37℃孵箱1 h，離心棄掉上清液，以HBSS洗2次，γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞攝碘水平。

結(jié) 果

1 RT-qPCR檢測(cè)NIS mRNA 分別給予K1及FTC133細(xì)胞不同濃度的蘿卜硫素處理24 h，結(jié)果顯示，蘿卜硫素可上調(diào)NIS mRNA水平，并且呈劑量依賴性(圖1)。

圖1 蘿卜硫素對(duì)K1及FTC133細(xì)胞NIS mRNA表達(dá)的影響(***P<0.001)

圖2 蘿卜硫素對(duì)K1及FTC133細(xì)胞攝碘率的影響

2 γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞攝碘能力 分別給予FTC133和K1細(xì)胞不同濃度蘿卜硫素處理24h，結(jié)果5μM，10μM及20μM蘿卜硫素對(duì)K1 細(xì)胞的攝碘率無(wú)明顯作用，40μM蘿卜硫素可明顯提高K1細(xì)胞系攝碘率(P<0.001)；而10μM蘿卜硫素即可提高FTC133細(xì)胞攝碘率，且隨濃度的增加而增加(圖2)。

討 論

分化型甲狀腺癌(DTC)占甲狀腺癌的90%左右，大多數(shù)分化型甲狀腺癌患者，經(jīng)手術(shù)、放射性碘以及甲狀腺素制劑替代治療后預(yù)后良好。鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)是一種糖蛋白，位于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜上，可以將血液中的-I選擇性、主動(dòng)性地轉(zhuǎn)運(yùn)至濾泡上皮細(xì)胞中，-I 經(jīng)過(guò)氧化物酶作用后，碘化甲狀腺球蛋白(Thyrogloulin，Tg)上的酪氨酸殘基，儲(chǔ)存在腺泡腔內(nèi)，通過(guò)溶酶體的作用，分解成甲狀腺激素，以囊泡的形式釋放到血液中， 調(diào)節(jié)全身的新陳代謝。DTC 濃聚131I的能力， 對(duì)其治療有著非常重要的意義。131I治療成為DTC術(shù)后處治的重要手段，但仍有約30%復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，病灶對(duì)131I存在抵抗[1]。其原因是多方面的：有NIS基因突變、NIS mRNA減少、NIS蛋白表達(dá)異常、TSH受體突變、多次131I治療后DTC細(xì)胞的退行性變，導(dǎo)致了攝碘功能的減低。Smit等[2]將hNIS基因轉(zhuǎn)染入帶有hNIS缺陷的濾泡性甲狀腺癌細(xì)胞系FTCl33中，實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)131I攝取增強(qiáng)。Shimura等[3]把rNIS的eDNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喪失聚碘功能的鼠甲狀腺細(xì)胞(FRTL-Tc)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Tc-rNIS)在離體情況下具有聚碘能力。因此，如何提高攝碘率為放射性碘治療分化型甲狀腺癌提供了新的思路。

組蛋白氨基端賴氨酸殘基的乙?；山档推渑cDNA的親和力，從而影響組蛋白與DNA的結(jié)合。組蛋白脫乙酰化酶抑制劑[Histone-deacetylase(HDAC)inhibitors]可以在轉(zhuǎn)錄后水平增強(qiáng)NIS基因表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞系給予一種HDAC抑制劑Triehostatin A(TSA)干預(yù)，腫瘤細(xì)胞NIS表達(dá)顯著增加，得出結(jié)論TSA治療與三種細(xì)胞系NIS表達(dá)增強(qiáng)存在直接關(guān)系[4]。蘿卜硫素富含于十字花科植物，屬于異硫氰酸鹽類。有研究顯示蘿卜硫素可作為HDAC抑制劑發(fā)揮抗癌作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)中，給予不同濃度的蘿卜硫素處理分化型甲狀腺癌細(xì)胞系K1及FTC133，結(jié)果表明，蘿卜硫素可上調(diào)NIS mRNA，并呈劑量依賴性，提高腫瘤細(xì)胞的攝碘率。若能夠通過(guò)應(yīng)用蘿卜硫素的誘導(dǎo)分化作用，誘導(dǎo)NIS基因的表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞向成熟階段分化，恢復(fù)或提高其攝碘能力，然后再結(jié)合放射性碘的聯(lián)合治療模式，則可能獲得滿意的臨床效果。

本實(shí)驗(yàn)是建立在體外細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上得出的結(jié)論，缺少體內(nèi)研究結(jié)果的證實(shí)。蘿卜硫素作用的機(jī)制尚不清楚，是否是通過(guò)HDAC抑制劑發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1] Dohán O1, De la Vieja A,Paroder V,etal. The sodium/iodide Symporter (NIS):Characterization, regulation, and medical significance[J].Endocr Rev,2003，24(1):48-77.

[2] 余永利，羅全勇，陳立波,等．分化型甲狀腺癌術(shù)后131I治療生存率分析[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,26(5):261-263.

[3] Smit J W，Shroder-Van D E J，Karperien M，etal．Reestablishment of in vitro and in vivo iodide uptake by transfection of the human sodium iodide symporter(hNIS)in a hNIS defectivehuman thyroid carcinoma cell line[J].Thyroid,2000,10(11):939-943．

[4] Zarnegar R，Brunaud L，Kananchi H，etal．Increasing the effectiveness of radioactive iodine therapy in the treatment of thyroid cancer using Trichostatin A，a histone deacety-lase inhibitor[J].Surgery,2002,132(6):984-990．

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(收稿：2015-03-02)

Effect of sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line

The Department of Endocrinology, Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Wang Liping

Objective: To study the effect of Sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line. Method: the thyroid cancer cell line K1 and FTC133 were treated with different concentrations of sulforaphane for 24h,the expression level of NIS mRNA of K1 and FTC133 were determined by RT-qPCR and their radioiodide concentration activity were measured by γ-counter. Results: Sulforaphane can up-regulate the expression of NIS in a dose-dependent manner and also increase the ability of radioiodide concentration of differentiated thyroid cancer line. Conclusion:Sulforaphane provides a new idea for radioactive iodine treatment of differentiated thyroid cancer.

Thyroid neoplasms/therapy Thiocyanates Glycophorins Iodine radioisotopes Gene expression

甲狀腺腫瘤/治療 硫氰酸類 糖蛋白類 碘放射性同位素 基因表達(dá)

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.003