高效液相色譜法測定銀花感冒沖劑中綠原酸含量

陳 述 席桂同

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091)

中藥研究

高效液相色譜法測定銀花感冒沖劑中綠原酸含量

陳 述 席桂同

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091)

目的:建立測試銀花感冒沖劑中綠原酸含量的高效液相方法，并對此方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，以確保應(yīng)用該方法測試的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。方法:采用色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美國)，流動相:甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85)，檢測波長為327 nm。結(jié)果:綠原酸在25～800 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得到線性回歸方程為Y=27.88X+2.128，相關(guān)系數(shù)為0.999 8(n=6);低、中、高濃度精密度的RSD值分別為0.59%、0.58%、0.44%;重復(fù)性RSD為0.26%;低、中、高濃度的加樣回收率分別為99.24%、99.43%、99.75%;供試品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定，RSD為0.29%。結(jié)論:本方法測定銀花感冒沖劑中綠原酸的含量準(zhǔn)確、可靠，操作簡單、用時短，可用于銀花感冒沖劑中綠原酸的含量測定。

高效液相色譜法;綠原酸;銀花感冒沖劑;含量測定

銀花感冒沖劑是臨床常用的感冒藥，由金銀花、連翹、防風(fēng)、桔梗、甘草五味藥制成，具有清熱，解表，利咽功效，臨床主要用于用于感冒發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛[1]。綠原酸是金銀花的主要有效成分之一，具有消炎抗菌、抗氧化、抗衰老、利膽降壓、抗腫瘤等藥理作用，是銀花感冒沖劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一[2]。筆者采用高效液相方法建立了實用、準(zhǔn)確、可靠的綠原酸含量檢測方法，通過方法學(xué)驗證，具體敘述如下。

1 實驗材料

1.1 儀器與設(shè)備 島津265型紫外分光光度計;Agilent 1290型高效液相色譜儀(配有脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、恒溫箱、液相色譜泵、柱溫箱及熒光檢測器)，由Chemstation化學(xué)工作站系統(tǒng)控制(Agilent，德國);METTLER TOLEDO AB135-S型十萬分之一天平(METTLER，瑞士);XW-80A渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);TGL16M型冷凍離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司);AHL-2001-P痕量型分析型超純水機(jī)(艾科浦，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥與材料 綠原酸對照品:由中國藥品生物制品檢定研究院提供，批號:110753-200413;銀花感冒沖劑:由內(nèi)蒙古某股份有限公司提供，批號:140106、140113、140120、140127、140210;磷酸:天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號:130315;甲醇:美國Tedia公司，色譜純，批號:1202257;純水:自制去離子超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美國);保護(hù)柱:Gemini C18(4 mm×3.0 mm，10 μm，Phenomenex，美國);流動相:甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85);流速:1.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。檢測波長327 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量流動相溶解后，再用流動相稀釋至刻度線，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的綠原酸對照品儲備溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取銀花感冒沖劑10包，精密稱定，研碎，精密稱取適量(約1 000 mg)，置于帶塞錐形瓶中，加入約20 mL 50%甲醇水溶液，超聲處理0.5 h，充分搖勻，冷卻至室溫，完全轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，再用50%甲醇水溶液定容至刻度線，搖勻。進(jìn)樣前用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液進(jìn)樣5 μL。

2.2.3 陰性對照液 制備缺少金銀花的空白銀花感冒沖劑(金銀花成分以基質(zhì)代替，其余處方同銀花感冒沖劑)，再按“2.2.2供試品溶液的配制”項下方法，配制成陰性樣品溶液。

2.3 檢測波長的選擇 以流動相作為空白對照，將綠原酸對照液和供試品溶液在紫外分光光度計上掃描，掃描區(qū)間為200～350 nm，結(jié)果得出，綠原酸在327 nm處顯示有最大吸收。因此，選擇327 nm作為檢測波長。

2.4 系統(tǒng)適用性與專屬性考察 分別取綠原酸對照品溶液、陰性對照液、供試品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL。記錄并觀察3份溶液的色譜圖。結(jié)果得出，綠原酸峰的理論塔板數(shù)不低于3 000，陰性對照液中無干擾峰干擾測定，對照液與供試液中綠原酸峰的保留時間一致，綠原酸峰周圍無干擾峰，基質(zhì)不干擾測定，本方法專屬性好。典型色譜圖如下圖1所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密移取濃度為1 mg/mL的綠原酸對照品儲備溶液適量，用流動相逐級稀釋成含綠原酸濃度為800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL等6個濃度級別的系列對照品工作溶液，進(jìn)樣5 μL。記錄各濃度綠原酸對照液的峰面積。結(jié)果得出，綠原酸在25～800 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，所得峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=27.88X+2.128，相關(guān)系數(shù)為0.999 8(n=6)。

圖1 專屬性考察圖譜

2.6 精密度考察 配制低、中、高濃度(綠原酸濃度為50 μg/mL、200 μg/mL、640 μg/mL)的對照品工作溶液，每個濃度平行配制5份，分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，見表1。結(jié)果得出，低、中、高濃度綠原酸的RSD值分別為0.59%、0.58%、0.44%，表明精密度良好。

表1 精密度考察結(jié)果

2.7 重復(fù)性考察 取同一批次的供試品6份，按照“2.2.2”項下方法配制成6份供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，見表2。結(jié)果得出綠原酸峰面積的RSD值為0.26%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表2 重復(fù)性考察結(jié)果

表3 加樣回收率考察結(jié)果

2.8 加樣回收率考察 精密移取同一已知(75.65 μg/mL)的供試品溶液1mL，平行5份，分別加入低、中、高濃度(綠原酸濃度為50 μg/mL、200 μg/mL、640 μg/mL)的對照品工作溶液1mL，混勻，進(jìn)樣，記錄峰面積，見表3。本實驗所得綠原酸低、中、高濃度的加樣回收率分別為99.24%、99.43%、99.75%，RSD分別為1.2%、0.8%、0.5%。

2.9 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(75.65 μg/mL)，分別在室溫下放置0 h、4 h、6 h、8 h后測定，記錄色譜峰，見表4。結(jié)果得出，在室溫下放置8 h后測定的RSD值為0.29%，可說明綠原酸供試品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定。

表4 室溫放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.10 樣品含量測定 取5個批次(批號分別為140106、140113、140120、140127、140210)的銀花感冒沖劑，按上述“2.2.2”項下方法配制成供試品溶液，取配制好的供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，每個批次平行測定3次，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計算銀花感冒沖劑中綠原酸的含量，含量計算結(jié)果見表5。5個批次的銀花感冒沖劑中綠原酸的含量分別為3.749 mg/g、3.751 mg/g、3.746 mg/g、3.746 mg/g、3.747 mg/g。

表5 含量測定結(jié)果

3 討論

銀花感冒沖劑是由金銀花、連翹、防風(fēng)、桔梗、甘草五味藥制成，具有清熱，解表，利咽功效，臨床主要用于用于感冒發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛。方中金銀花為君藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效[3]。金銀花中含有的化學(xué)成分很多，主要包括有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類、皂苷類等。有機(jī)酸類化合物是金銀花最重要的化學(xué)組成部分，也是最主要的有效成分，包括綠原酸、異綠原酸、棕櫚酸等[4]。綠原酸是其主要成分，是金銀花抗菌消炎藥效特征的有效成分。綠原酸不僅僅是金銀花生藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，也是含有金銀花的中成藥或制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

目前綠原酸的測定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。2010版《中華人民共和國藥典》中確定了金銀花中綠原酸的高效液相測定方法，一些學(xué)者也進(jìn)行了綠原酸的含量測定方法研究，并取得了很好的研究成果[6-10]。肖文平等[11]應(yīng)用紫外分光光度法，對比分析對不同花期的金銀花應(yīng)用不同的提取方法所測得的金銀花中綠原酸的含量，研究結(jié)果得出，乙醇回流法的提取效率高于超聲提取，花苞期金銀花中綠原酸的含量高于金銀花原液。鐘方曉[12]采用了紫外分光光度法和高效液相色譜法兩種方法分別測定了金銀花中綠原酸和異綠原酸的含量，研究發(fā)現(xiàn)，紫外分光光度法測得結(jié)果為綠原酸和異綠原酸的總含量，高效液相方法則能將二者的含量分開測定，實驗數(shù)據(jù)證實，高效液相法所得綠原酸和異綠原酸的含量之和與紫外分光光度計測得的數(shù)據(jù)基本相符。說明紫外分光光度法不適宜單獨測定綠原酸的含量[13-14]。

為了更方便快捷、準(zhǔn)確有效的做好銀花感冒沖劑的質(zhì)量控制工作，筆者應(yīng)用高效液相方法對銀花感冒沖劑中綠原酸的含量進(jìn)行了測定，對各項條件進(jìn)行了摸索，最終確定了適宜的流動相，波長，供試品處理方法等條件，建立了一套高效、可靠的方法。流動相是應(yīng)用甲醇-0.5%磷酸溶液(15∶85)，流速為1.2 mL/min，該色譜條件下，綠原酸峰型良好，能取得很好的分離度，綠原酸峰周圍無干擾峰，無基質(zhì)干擾測定。通過方法學(xué)驗證得出結(jié)果，低、中、高濃度的精密度良好，RSD值分別為0.59%、0.58%、0.44%;重現(xiàn)性好，重現(xiàn)性RSD值為0.26%;該方法實驗所得低、中、高濃度的加樣回收率分別為99.24%、99.43%、99.75%。實驗測得本次抽取的5個批次(批號分別為140106、140113、140120、140127、140210)的銀花感冒沖劑中綠原酸的含量分別為3.749 mg/g、3.751 mg/g、3.746 mg/g、3.746 mg/g、3.747 mg/g。本研究結(jié)果與李建芳等人研究結(jié)果大體一致[2]，但本實驗制劑中所含綠原酸的含量略高，這與制劑配方及金銀花的類別，供試品的提取處理方法有一定的關(guān)系。

總之，本方法用于測定銀花感冒沖劑中綠原酸的含量準(zhǔn)確、可靠，操作簡單、用時短，可用于銀花感冒沖劑的含量測定，用于該制劑的質(zhì)量控制。

[1]許佩蘭.復(fù)方銀花感冒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，30(9):114.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:205.

[3]李建芳，黃勁通.高效液相色譜法測定銀花感冒沖劑中綠原酸含量[J].中國藥業(yè)，2013，22(14):63-64.

[4]李錦燊，吳洪文.HPLC同時測定山銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J].北方藥學(xué)，2013，10(8):10-11.

[5]周惠燕，陳玨.金銀花提取物中綠原酸含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(11):61-62.

[6]張莉，王學(xué)芳，李德華.HPLC法測定銀花利咽片中綠原酸的含量[J].海峽藥學(xué)，2011，23(11):68-70.

[7]張雷.抗感冒沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14(4):231-232.

[8]唐德智.HPLC測定銀花感冒顆粒中綠原酸含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15(8):73-74.

[9]江帆，郭培果.HPLC法測定兒感口服液中綠原酸的含量[J].中國藥房，2009，20(33):2600-2602.

[10]何兵，田吉，肖順漢.HPLC測定楤木葉中綠原酸的含量[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，33(3):229-231.

[11]馬彥芳.金銀花中總黃酮的含量測定[J].青海科技，2007，14(4):29-30.

[12]鐘方曉.高效液相及紫外分光光度法測定金銀花中綠原酸和異綠原酸含量方法學(xué)比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16(3):212.

[13]鄧育平.高效液相色譜法測定金銀花含片中綠原酸含量[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008(14):11-12.

[14]汪洪武，劉艷清.HPLC測定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸與黃芩苷含量[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44(9):706-708.

(2014-04-26收稿 責(zé)任編輯：王明)

Determination of the Contents of Chlorogenic Acid in Yinhuaganmao Granules by HPLC

Chen Shu,Xi Guitong

(XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Objective:To establish a high performance liquid phase method to measure the content of chlorogenic acid of Flos Lonicerae in Ganmao granules,and to ensure that the results are accurate and reliable by systematic methodology.Methods:The chromatographic column:Agilent TC-C18 column (4.6 × 150 mm,5 μ m,Agilent,American),a mobile phase of methanol:-0.5% phosphoric acid solution (15:85),the detection wavelength was 327 nm.Results:The chlorogenic acid in 25ug mL-1-800ug·mL-1linear relationship was good,the linear regression equation was Y = 27.88X+2.128,correlation coefficient was 0.999 8 (n = 6); low,high concentrations of RSD precision,values were 0.59%,0.58%,0.44%; repetitive RSD 0.26%; low,recoveries.The high concentration were respectively 99.24%,99.43%,99.75%; the test solution was placed at room temperature for 8 h,and RSD was 0.29%.Conclusion:This method for determination of the content of chlorogenic acid in Flos Lonicerae cold granule is accurate and reliable with simple operation and short time.It can be used for the determination of chlorogenic acid in Flos Lonicerae in Ganmao granules.

HPLC; Chlorogenic acid; Yinhuaganmao granules; Content determination

席桂同，主管藥師，地址:北京市海淀區(qū)西苑醫(yī)院藥劑科，郵編：100091

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.026