“從腸論治”對哮喘小鼠BALF炎癥細胞及血清IgE含量的影響

劉 妙 鄭豐杰 高譽珊 張淑靜 張?zhí)煊?孫 燕 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

“從腸論治”對哮喘小鼠BALF炎癥細胞及血清IgE含量的影響

劉 妙 鄭豐杰 高譽珊 張淑靜 張?zhí)煊?孫 燕 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：觀察“從腸論治”對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及血清IgE含量的影響，為探討“肺與大腸相表里”理論提供實驗依據(jù)。方法：采用卵清蛋白(OVA)致敏激發(fā)方法制備過敏性哮喘小鼠模型，芒硝灌胃刺激，進行小鼠氣道反應(yīng)性試驗，肺組織形態(tài)學(xué)觀察，肺支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)、血清IgE含量檢測。結(jié)果：與正常組相比，OVA組小鼠氣道阻力增加，肺組織出現(xiàn)炎性病理改變，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞總數(shù)明顯增加，血清IgE含量均明顯升高；經(jīng)芒硝從腸干預(yù)后，芒硝組小鼠氣道阻力明顯降低，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定程度的改善，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞總數(shù)明顯減少，血清IgE含量顯著降低。結(jié)論：芒硝刺激大腸，有助于改善氣道通氣功能，抑制哮喘小鼠氣道炎癥，改善氣道免疫微環(huán)境。

從腸論治；肺合大腸；支氣管哮喘

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以多種反復(fù)出現(xiàn)的可逆性氣流阻塞和氣管痙攣為特征的氣道慢性炎癥性疾病，以嗜酸性粒細胞(EOS)、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞(PMN)、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等炎性細胞浸潤為主要免疫病理改變[1]。IgE主要由呼吸道、消化道黏膜固有層淋巴組織中的B細胞合成，為過敏反應(yīng)的主要介導(dǎo)因子，其增加與哮喘的觸發(fā)和嚴(yán)重程度有關(guān)[2]。

“肺與大腸相表里”理論是中醫(yī)臟腑相關(guān)理論的重要組成部分，“從腸論治”是在該理論指導(dǎo)下治療肺系疾病的常用治療方法之一，即應(yīng)用具有瀉下作用的藥物通利大腸以達到治療肺系疾病的目的。常用的瀉下藥主要有刺激性瀉藥和容積性瀉藥，刺激性瀉藥主要作用機制是直接刺激腸壁，促進腸蠕動，從而推動糞便排出；容積性瀉藥的主要作用機制是在腸內(nèi)形成高滲透壓，使水分和食糜容量增大，引起機械性地刺激，使腸蠕動增強而產(chǎn)生排便。本課題組前期研究已經(jīng)證明，刺激性瀉藥大黃“從腸論治”，可在一定程度上降低慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠的外周血和肺泡灌洗液中細胞因子含量，減輕全身及局部的炎癥反應(yīng)[3]。為了進一步探討“從腸論治”的效應(yīng)機制，我們觀察了容積性瀉藥芒硝對哮喘小鼠氣道阻力及肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，并檢測了肺泡灌洗液中炎癥細胞及血清Immunoglobulin E(IgE)的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物制備 芒硝(Na2SO4·10H2O，中國陜西產(chǎn))，購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定為正品。參文獻[4]按人常用量9 g/d折算出小鼠單位體重芒硝的用量為1.0 g/kg。參文獻[5]采用傳統(tǒng)的溫開水溶化的方法制備芒硝藥液，參文獻[6]采用離子色譜法進行芒硝藥液的質(zhì)量控制。

1.1.2 動物與分組 清潔級、健康、雌性BALB/C小鼠，鼠齡6～8周，體重18～20 g(購于北京維通利華實驗動物公司，合格證號:SCXK(京)2007—0001)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字表法將45只隨機分為正常對照組(簡稱正常組)、哮喘模型組(簡稱OVA組)和OVA+芒硝組(簡稱芒硝組)，每組15只。

1.1.3 模型制備 參文獻[7]采用OVA(GradeⅤ;Sigma-Aldrich)致敏激發(fā)法制備哮喘小鼠模型，即在第1天和第14天，每只小鼠腹腔注射100 μg的OVA與4 mg氫氧化鋁混懸液0.1 mL致敏。第21～23天，置于20 cm×30 cm×40 cm的動物霧化箱中，與YC-Y800亞都醫(yī)用霧化器(YC-Y800,Yadu Corp.，Beijing，China)連接，用3 g/L的OVA溶液霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每日1次，持續(xù)3 d。

實驗期間，各組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)；第17～23天，芒硝組每天1次給予中藥芒硝藥液灌胃。用量1.0 g/kg，每天1次，連續(xù)7 d。正常組、OVA組分別給予等量蒸餾水灌胃。所有動物在最后1次OVA激發(fā)48 h后處死，取材。

1.2 方法

1.2.1 氣道激發(fā)試驗 末次激發(fā)48 h后，采用實驗小動物肺功能測定儀AniRes 2005 lung function system(Bestlab，AniRes 2005，version 2.0，China)測定氣道阻力，每組5只。操作步驟為：0.2%戊巴比妥腹腔麻醉后，行氣管切開、氣管插管，將小鼠放入密閉的體描箱中，連接小型動物呼吸機行輔助通氣，動物呼吸機參數(shù)設(shè)置為：呼吸頻率90次/min，呼吸比為1.5∶1.0，潮氣量為6 mL/kg。每只小鼠分別給予逐漸增加的氯化乙酰膽堿(Sigma，US)0.0125、0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg，給藥后連續(xù)記錄5 min。

1.2.2 肺部炎癥組織學(xué)觀察 取小鼠肺組織，用4%的多聚甲醛中性緩沖液灌注固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木精-伊紅染色(Histology Examination，H&E)染色，每組2只。

1.2.3 肺支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數(shù) 眼球取血后脫頸處死小鼠，剪切開頸部，暴露氣管及肺臟，分離氣管，結(jié)扎一側(cè)主支氣管，剪開左側(cè)氣管，將導(dǎo)管插入氣管內(nèi)1cm固定，分3次緩慢注入0.9%氯化鈉溶液0.4 mL，每次灌洗后立即回收置于離心管中計量，確?；厥章试?5%以上。將支氣管肺泡灌洗液4℃(1000 r/min)離心10 min，取離心后沉淀物涂片，瑞氏染色，進行細胞分類計數(shù)。

1.2.4 血清IgE含量檢測 采用眼球取血法取血，室溫靜置2 h后離心分離血清(200 r/min，10 min)，-80°C冷藏。采用ELISA試劑盒檢測血清IgE的含量。具體步驟按試劑盒中的說明書進行操作(BD Biosciences，San Diego，CA)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；兩兩比較方差齊者采用LSD(Least-significant difference)檢驗，方差不齊者采用Dunnett'T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 氣道高反應(yīng)性分析(mean±SD，n=5)

注：Re:呼氣阻力。結(jié)果以mean±SD表示。與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 氣道反應(yīng)性比較 不同濃度氯化乙酰膽堿(ACH)激發(fā)后，各組小鼠氣道阻力變化見圖1。與正常組相比，在ACH濃度為0.0125 mg/kg、0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg時，模型組小鼠氣道阻力均明顯增加(10.03±2.628 vs 5.06±2.375，18.05±4.379 vs 8.09±4.523，21.21±0.568 vs 10.91±1.981，30.66±7.668 vs 13.47±1.523，104.15±35.225 vs 22.66±3.809)；與模型組相比，經(jīng)芒硝從腸干預(yù)后，在ACH濃度為0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg時，小鼠氣道阻力明顯降低(12.55±5.965；20.39±7.528；38.84±18.283)。

2.2 組織學(xué)觀察 H&E染色顯示：正常組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡上皮細胞排列有序，肺泡壁厚度正常。哮喘模型組小鼠氣管壁增厚，褶皺增多，細胞排列雜亂，黏膜下及管周可見以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤。芒硝干預(yù)后上述病理改變有所好轉(zhuǎn)(圖2)。

圖2 哮喘小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(H&E染色×400)

2.3 肺支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalverolarlavagefluid，BALF)細胞分類計數(shù) 各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞分類計數(shù)結(jié)果表明：正常組小鼠BALF中未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞，OVA組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞總數(shù)明顯增加(P<0.01)，經(jīng)芒硝從腸干預(yù)后，芒硝組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)明顯降低(P<0.01)。與正常組相比，OVA組小鼠BALF中淋巴細胞計數(shù)明顯增加(P<0.01)；芒硝從腸干預(yù)后，芒硝組小鼠淋巴細胞計數(shù)明顯降低(P<0.05)(表1)。

表1 肺支氣管肺泡灌洗液中細胞分類計數(shù)檢測 (×104/mL，Mean±SD)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVA組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各組小鼠血清IgE含量檢測(μg/mL)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVA組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 血清IgE含量分析 與正常組相比，OVA組小鼠血清IgE含量均明顯升高(5.95±0.249 vs 4.36±0.271，P<0.05)。與OVA組相比，芒硝組小鼠血清IgE含量明顯降低(5.38±0.131，P<0.05)。(表2)

3 討論

哮喘是由多種炎癥細胞和炎癥遞質(zhì)參與的慢性炎癥性氣道反應(yīng)，同時伴有氣道高反應(yīng)性[1]。

中醫(yī)學(xué)“肺與大腸相表里”理論認(rèn)為，肺與大腸之間存在著某種特異性聯(lián)系，這種聯(lián)系在臟器的生理、病理上有著密不可分的依賴關(guān)系。肺臟疾病可以影響到大腸[8-9]，大腸病變也可以影響到肺[10-12]。長期的臨床實踐證實，在慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、急性呼吸窘迫綜合征等肺系疾病的治療中，采用“從腸論治”的方法可有效改善臨床癥狀，提高藥物治療的療效[13-17]。

本課題組以往的研究證實，以刺激性瀉藥大黃從腸干預(yù)，可以改善COPD模型大鼠氣道通氣及肺功能[18]，抑制氣道重構(gòu),改善通氣障礙[19]，同時可以減輕肺組織損傷[20]，減輕全身及局部的炎癥反應(yīng)[2]。本試驗在此基礎(chǔ)上，進一步觀察容積性瀉藥芒硝“從腸論治”的效應(yīng)機制。

芒硝(Mirabilite)作為容積性瀉藥的代表藥，其主要成分為含水硫酸鈉(Na2SO4·10H2O)，溶化或煎汁內(nèi)服后，硫酸根離子不易被腸黏膜吸收，在腸道內(nèi)形成高滲溶液，使腸內(nèi)水分增加，引起機械刺激，促進腸蠕動，從而發(fā)生排便反應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為，芒硝具有瀉熱通便、潤燥軟堅、清火消腫之功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“味苦寒，主百病，除寒熱邪氣，逐六臟積聚，結(jié)固留癖，能化七十二種石。”因此，芒硝也是《傷寒論》大承氣湯及調(diào)胃承氣湯發(fā)揮瀉下作用的主要藥物之一。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，OVA組小鼠氣道阻力明顯增加，氣管壁增厚，褶皺增多，細胞排列雜亂，黏膜下及管周可見以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，而芒硝刺激大腸后，模型小鼠氣道阻力則顯著降低，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定程度的好轉(zhuǎn)，提示經(jīng)芒硝“從腸論治”可有效改善哮喘模型小鼠氣道通氣功能，減輕病理改變。此外，OVA組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞顯著增多，血清IgE水平顯著上升，而經(jīng)芒硝刺激大腸后，芒硝組小鼠血清中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞總數(shù)均明顯減少，血清IgE含量明顯降低。這表明，基于“肺與大腸相表里”理論，使用容積性瀉藥芒硝“從腸論治”可以有效抑制哮喘小鼠氣道炎癥，改善氣道免疫微環(huán)境，這可能也是其改善哮喘氣道通氣功能及組織病理改變的機制之一。

綜上所述，本課題基于不同肺部炎癥疾病動物模型，觀察發(fā)現(xiàn)不論容積性瀉藥還是刺激性瀉藥，“從腸論治”均可對肺部炎癥疾病起到一定的治療作用，這既印證了“肺與大腸相表里”理論，又為進一步研究肺病“從腸論治”的肺-腸聯(lián)絡(luò)機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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(2014-12-05收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Effect of Relaxing the Large Intestine on BALF inflammatory cell and Serum IgE in Asthma Mices

Liu Miao, Zheng Fengjie, Gao Yushan, Zhang Shujing, Zhang Tianyu, Sun Yan, Li Yuhang

(SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the biological foundation for the TCM theory of the interior-exterior relationship between the lung and the large intestine, we conducted an experiment to evaluate the content of eosinophils and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and IgE in blood serum after the asthma modeled mice were intervened with mirabilite at large intestines. Methods: Asthma model mice were established by OVA sensitization. Airway responsiveness, histopathology change, classification and counting of the cells of BALF and content of blood serum IgE were observed after large intestine was stimulated by mirabilite. Results: Compared with the normal rats, the asthma model rats' airway resistance increased obviously, the number of eosinophils and neutrophils in BALF and IgE in blood serum significantly increased. After intervened with mirabilite, airway resistance decreased obviously, eosinophils and neutrophils in BALF and IgE in blood serum significantly lowered. Conclusion: Stimulating the large intestine by mirabilite showed beneficial effects in alleviating airway responsiveness and airway inflammation, and improving airway immune microenvironment in asthma mice model.

Relaxing the large intestine; Interior-exterior relationship between the lung and large intestine; Bronchiolar asthma

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(編號：2009CB522704)；北京中醫(yī)藥大學(xué)“經(jīng)方現(xiàn)代應(yīng)用關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究”創(chuàng)新團隊(編號：2011-CXTD-04)

劉妙(1986—)，女，博士研究生，研究方向：中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究，E-mail：liumiao124@hotmail.com

李宇航，教授，地址：北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)教研室，北三環(huán)東路11號，郵編：100029，電話：(010)64287503，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn

R223.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.006