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      H2O2對(duì)牡丹愈傷組織分化及抗氧化酶活性的影響

      2015-03-19 13:43:46賀丹毛倉(cāng)倉(cāng)陳穎王政何松林
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年1期
      關(guān)鍵詞:胚性體細(xì)胞牡丹

      賀丹 毛倉(cāng)倉(cāng) 陳穎 王政 何松林

      摘要:以鳳丹白牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)繼代愈傷組織為材料,研究不同外源H2O2濃度下牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化,探究酶活性變化與牡丹愈傷組織生長(zhǎng)、分化的關(guān)系。結(jié)果表明,在愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中,當(dāng)H2O2濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí),愈傷組織形態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的變化;100 μmol/L H2O2處理的SOD活性在第5天達(dá)到峰值,與其他處理呈顯著差異,之后逐漸下降;POD和CAT活性變化基本一致,在第5天出現(xiàn)明顯上升,之后下降,然后趨于平穩(wěn)。從形態(tài)觀察和3種抗氧化酶活性結(jié)果來(lái)看,100 μmol/L H2O2對(duì)牡丹胚性愈傷組織的形成和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。

      關(guān)鍵詞:外源H2O2;牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.);愈傷組織分化;抗氧化酶活性

      中圖分類號(hào):S685.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)01-0122-04

      牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)別名木芍藥、富貴花,為芍藥科芍藥屬宿根木本花卉[1]。目前,生產(chǎn)上仍以播種、分株、嫁接等傳統(tǒng)方法進(jìn)行繁殖,其結(jié)實(shí)率低,無(wú)性繁殖速度慢等問(wèn)題限制了品種選育工作的開(kāi)展。組織培養(yǎng)技術(shù)為縮短牡丹的繁育周期提供了可能,但還沒(méi)有形成較完善的技術(shù)體系[2]。牡丹愈傷組織分化困難一直是制約再生體系建立的瓶頸[3],通過(guò)直接途徑獲得了少量的牡丹體細(xì)胞胚[4,5]。通過(guò)間接途徑即體細(xì)胞誘導(dǎo)成胚性愈傷組織,胚性愈傷組織再發(fā)育成體胚,誘導(dǎo)產(chǎn)生牡丹體胚尚未見(jiàn)報(bào)道。

      過(guò)氧化氫(H2O2)是活性氧的重要代表之一,激素等信號(hào)以及生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累。近年來(lái),有學(xué)者認(rèn)為H2O2可能是一種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì),有可能通過(guò)細(xì)胞的信號(hào)傳遞系統(tǒng)影響基因的調(diào)控表達(dá),從而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成[6,7]。從本質(zhì)上講,胚性愈傷組織的形成過(guò)程也就是愈傷組織的分化過(guò)程,這一過(guò)程的核心是基因的差別表達(dá)。有研究表明,在枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中,一定濃度的外源H2O2可提高愈傷組織中體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率,對(duì)細(xì)胞分化及體細(xì)胞胚發(fā)生有促進(jìn)作用[7]。過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性的變化與愈傷組織的生長(zhǎng)及分化過(guò)程密切相關(guān)。有研究表明,在枸杞的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中,3種酶相互配合來(lái)調(diào)節(jié)胚性細(xì)胞的分化與發(fā)育,且在胚胎發(fā)生與發(fā)育過(guò)程中具有特異性變化[7];在大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中,這3種酶活性的變化與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體胚的發(fā)育密切相關(guān)[8];POD在石刁柏和小麥的體細(xì)胞胚胎發(fā)生、發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,其活性均高于對(duì)照[9,10]。本研究以鳳丹白牡丹的繼代愈傷組織為材料,嘗試?yán)猛庠碒2O2誘導(dǎo)牡丹胚性愈傷組織,研究誘導(dǎo)過(guò)程中POD、CAT和SOD活性的變化,探究酶活性變化與愈傷組織生長(zhǎng)、分化的關(guān)系,旨在為牡丹體細(xì)胞胚的發(fā)生提供研究基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      2012年2月采集鳳丹白牡丹鱗芽,采集地點(diǎn)為洛陽(yáng)市土橋花木種苗有限公司牡丹苗木基地。將鱗芽滅菌后接種到MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖(pH 5.8)的固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)30 d后獲得牡丹試管苗。然后將試管苗的葉柄在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2,4-D +7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖(pH 5.8)的固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)40 d后獲得愈傷組織。愈傷組織在無(wú)菌條件下再轉(zhuǎn)入MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖(pH 5.8)的固體培養(yǎng)基上,進(jìn)行增殖培養(yǎng),獲得繼代愈傷組織。以上培養(yǎng)條件均為溫度(24±1) ℃,光照度40 μmol/(m2·s),光照時(shí)間12 h/d。

      1.2 試驗(yàn)方法

      將獲得的鳳丹白繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入添加有4種不同濃度H2O2(處理Ⅰ 50 μmol/L、處理Ⅱ 100 μmol/L、處理Ⅲ 200 μmol/L、處理Ⅳ 300 μmol/L)的MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖(pH 5.8)的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),每處理接種20瓶。

      1.3 測(cè)定方法

      供試材料轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后,分別于0、5、10、15、20、25 d進(jìn)行隨機(jī)取樣。準(zhǔn)確稱取材料0.2 g,加2 mL磷酸緩沖液(50 mmo1/L,含1%PVP及0.2 mmo1/L EDTA,pH 7.8)及少量石英砂,于冰浴中研磨,勻漿液于4 ℃,12 000 r/min離心15 min,上清液用于酶活性的測(cè)定,3次重復(fù)。

      POD、CAT活性測(cè)定參照李合生[11]的方法,略加改動(dòng)。SOD活性測(cè)定參照趙世杰[12]的方法。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

      試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法(SSR法)檢測(cè)其差異顯著性,采用Excel軟件和DPS軟件3.01版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 H2O2對(duì)牡丹愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響

      供試材料轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后,經(jīng)過(guò)25 d的培養(yǎng)后,觀察牡丹愈傷組織的生長(zhǎng)變化,結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出,在不同濃度H2O2處理?xiàng)l件下,牡丹愈傷組織的生長(zhǎng)呈不同的變化。處理Ⅰ的愈傷組織呈綠色至黃綠色,形態(tài)較致密;處理Ⅱ出現(xiàn)了一定程度的褐化,愈傷組織表面及邊緣出現(xiàn)較多類似球形胚的凸起,與周?chē)鷤M織易于剝離;處理Ⅲ與處理Ⅳ愈傷組織表面出現(xiàn)少量凸起,多呈黃綠色至白色,處理Ⅳ的褐化情況較嚴(yán)重,接種的20瓶中均有不同程度的污染。endprint

      2.2 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中POD活性的變化

      如圖2所示,牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后,4個(gè)處理愈傷組織的POD活性整體呈上升-下降-平穩(wěn)的趨勢(shì)。其中0~5 d,除處理Ⅲ外,其他處理的POD活性均大幅上升;5~10 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的POD活性急速下降,處理Ⅲ愈傷組織的POD活性呈緩慢下降的趨勢(shì),并于第10天出現(xiàn)最低值132.75 U/(g·min);10~15 d,處理Ⅰ愈傷組織的POD活性平緩下降,處理Ⅱ、Ⅳ愈傷組織的POD活性繼續(xù)大幅下降,而處理Ⅲ的POD活性則緩慢上升;15~25 d,處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ愈傷組織的POD活性則保持緩慢上升的趨勢(shì),第25天分別達(dá)到279.94、309.38、308.06 U/(g·min)。從POD活性的整體變化來(lái)看,除處理Ⅲ外,其他處理在5 d前后出現(xiàn)了劇烈變化,15 d后變化趨于平緩。

      2.3 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中SOD活性的變化

      如圖3所示,將牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后,4個(gè)處理的SOD活性整體變化趨勢(shì)較為平緩。其中0~5 d,4個(gè)處理的SOD活性均有上升,處理Ⅱ的變化最大,達(dá)到了382.56 U/(g·min);5~10 d,處理Ⅱ的SOD活性有小幅下降,并于第10天出現(xiàn)較低值317.69 U/(g·min),而處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的SOD活性均呈上升趨勢(shì);10~15 d, 4個(gè)處理的SOD活性均緩慢上升,且于第15天分別達(dá)到342.58、340.71、348.21、347.44 U/(g·min);之后,4個(gè)處理的SOD活性呈下降趨勢(shì),第25天分別降至219.72、177.33、201.61、291.62 U/(g·min)。從SOD的活性變化來(lái)看,處理Ⅱ的SOD活性在第5天達(dá)到了峰值,并與其他處理顯著差異。

      2.4 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中CAT活性變化

      如圖4所示,將牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后,0~5 d,4個(gè)處理的CAT活性均呈上升趨勢(shì);5~10 d時(shí),又迅速下降;10~15 d,處理Ⅰ、Ⅱ的CAT活性持續(xù)下降,并于第15天降至最低值237.5、187.5 U/(g·min),而處理Ⅳ的CAT活性則又出現(xiàn)上升;15~20 d,處理Ⅲ的CAT活性繼續(xù)下降并于第20天出現(xiàn)最低值187.5 U/(g·min);20~25 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的CAT活性保持快速上升趨勢(shì),處理Ⅳ的CAT活性則緩慢下降。

      3 小結(jié)與討論

      本試驗(yàn)研究H2O2對(duì)牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的作用,通過(guò)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)形態(tài)的觀察及抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性的測(cè)定,初步發(fā)現(xiàn)一定濃度的H2O2對(duì)誘導(dǎo)牡丹體細(xì)胞胚形成起促進(jìn)作用。這3種酶與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有密切關(guān)系,它們相互配合調(diào)節(jié)胚性愈傷組織的生長(zhǎng)與分化[8]。

      崔凱榮等[7]、邢更妹等[13]認(rèn)為當(dāng)繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后,SOD活性呈上升趨勢(shì),直到多細(xì)胞原胚期,SOD活性達(dá)到最高峰,表明SOD活性升高對(duì)胚性細(xì)胞的分化以及早期胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中第5天,除處理Ⅱ的SOD活性達(dá)到峰值,之后下降,而其他處理的變化趨勢(shì)較為平緩,因此在本試驗(yàn)中處理5 d可能是胚性細(xì)胞分化的時(shí)期。崔凱榮等[7]以枸杞為材料進(jìn)行研究,結(jié)果表明轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基的繼代愈傷組織只有在SOD活性升高時(shí)才會(huì)發(fā)生細(xì)胞分化,同時(shí)認(rèn)為細(xì)胞的分化取決于SOD與H2O2的相互作用。另外,很多研究表明,胚性愈傷組織中SOD、POD、CAT的活性均較高[15],說(shuō)明胚性愈傷組織細(xì)胞的適應(yīng)性、抗逆性強(qiáng)于非胚性愈傷組織,能夠?yàn)榕咝约?xì)胞分化、體胚的產(chǎn)生創(chuàng)造有利的條件[16,17]。POD與CAT是與清除H2O2相關(guān)的酶類[18],本試驗(yàn)中當(dāng)H2O2濃度為100 μmol/L時(shí),兩者的變化基本一致,這與枸杞[7]、木薯[19]的體胚發(fā)生過(guò)程中POD、CAT活性變化趨勢(shì)相一致。而詹園鳳等[8]在研究大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn),POD活性的變化趨勢(shì)與SOD和CAT活性的變化趨勢(shì)相反,這可能是不同作物體胚發(fā)生過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)方式不同所致。

      在體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及發(fā)生時(shí)間方面,不同物種的差異不大。枸杞在由繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后,經(jīng)3 d培養(yǎng)即開(kāi)始有胚性細(xì)胞形成,15 d左右時(shí)即形成大量球形胚[7]。櫻桃番茄在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后,14 d球形胚開(kāi)始形成,經(jīng)歷心形胚、魚(yú)雷胚后35 d開(kāi)始形成子葉胚[20]。石刁柏在培養(yǎng)1個(gè)月后,可以在培養(yǎng)物中挑選出愈傷組織、球形胚、梨形胚、成熟胚等[21]。本試驗(yàn)的形態(tài)觀察和3種抗氧化酶活性的結(jié)果表明,100 μmol/L H2O2對(duì)牡丹胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用,后期應(yīng)在培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時(shí)間等方面進(jìn)一步深入研究,以獲得理想的結(jié)果。

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