雞馬立克氏病的診斷

石麗娟

摘要：雞馬立克氏病是由皰疹病毒引起的雞的一種淋巴細(xì)胞增生性、高度接觸性傳染病。利用解剖學(xué)、組織學(xué)、血清學(xué)和病毒學(xué)檢查對疑似雞馬立克氏病進(jìn)行了診斷。

關(guān)鍵詞：雞馬立克氏?。辉\斷；防治

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）12-0014-03

馬立克氏?。∕areks disease，MD）是由馬立克氏病皰疹病毒引起的傳染性腫瘤性疾病，是最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病[1]。以外周神經(jīng)包括虹膜、皮膚在內(nèi)的各種器官和組織的單核性細(xì)胞浸潤為特征[2]。馬立克氏病對1日齡雛雞最易感染，2～18周齡雞均可發(fā)病。母雞比公雞易感性高。潛伏期常為3～4周，一般在50日齡以后出現(xiàn)癥狀，70日齡后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，90日齡以后達(dá)到高峰，偶見3～4周齡的幼齡雞和60周齡的老齡雞發(fā)病。該病的發(fā)病率變化很大，一般肉雞為20%～30%，個別達(dá)60%；產(chǎn)蛋雞為10%～15%，嚴(yán)重達(dá)50%，死亡率與之相當(dāng)。MD 存在于世界上所有養(yǎng)禽國家和地區(qū)，隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化程度的提高，其危害增大，受害雞群的損失可高達(dá)50%以上。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 丹東市某地區(qū)某農(nóng)戶送檢的病死雞30只，雛雞20只。

1.1.2 試劑 MD陽性血清、MD沉淀抗原、甲醛、乙醇（95%）、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、曙紅、NACL。

（1）陽性血清的制備：用已知的標(biāo)準(zhǔn)MD抗原與雞群中慢性病雞或康復(fù)雞的血清做瓊脂凝膠試驗，如出現(xiàn)清晰的沉淀線，則為MD陽性血清。采血分離血清加0.01%硫柳汞防腐，凍結(jié)保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）瓊脂平板制備：用含8%NaCL的硝酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）配制1%瓊脂糖，水浴加熱使瓊脂糖充分溶解，多層紗布過濾，將無菌平皿（直徑9 cm）置水平臺上，每個平皿倒入融化的瓊脂糖約15～20 mL[13]。使其厚度為2.5～3.0 mm。注意傾倒時勿產(chǎn)生氣泡，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

在已制備的瓊脂板上，用打孔器按六角形圖案打孔，或用梅花形打孔器。中央打1個孔，孔徑4 mm，周圍打6個孔，孔徑3 mm，中央孔與周圍孔孔距為3 mm。將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向挑出，勿損壞孔的邊緣，避免瓊脂層脫離平皿底部[14]。將平皿底部置80～90 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)數(shù)秒鐘，或放在酒精燈火焰上緩緩加熱，微微燙即可。使孔底邊緣的瓊脂少許熔化以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。

1.1.3 儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHG-9053A型）、切片機(jī)、水浴鍋、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術(shù)刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹膠、新鮮蛋白、1 mL注射器、三分試管、加樣器、加樣滴頭、打孔器、瓊脂擴(kuò)散平板等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病死雞剖檢 將送檢的病例進(jìn)行尸體剖檢，外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕，切開大腿與腹側(cè)連接的皮膚，用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關(guān)節(jié)脫臼，使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線，由此切線中部沿腹中線由后向前剪開皮膚，直到喙角，使腹部和胸部皮膚分離，進(jìn)行臨床剖檢診斷。在臨床癥狀觀察、尸體剖檢的基礎(chǔ)上，從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實驗室檢驗，以尋求確診。

1.2.2 病理組織切片

（1）切片制備。固定：用福爾馬林固定24 h。浸洗：用自來水沖洗組織塊24 h。脫水：洗滌后組織塊在70%、80%、90%、95%、100%（A），100%（B）乙醇中每級各停留2 h。透明：把組織塊放到二甲苯中至透明。浸蠟與包埋：將已透明的材料放入石蠟中，使材料中充滿石蠟；將包埋用的石蠟倒入小瓷槽內(nèi)，用鑷子將浸過石蠟的材料放入倒有石蠟的小瓷槽內(nèi)，當(dāng)表面冷卻后，將小瓷槽輕快地放入冷水中，使蠟塊浮起后，即可收取，待切。切片：首先將包埋于同一蠟塊中的材料分開，使每一小蠟塊中只含有一塊材料；然后，將蠟塊修成四方形或長方形，并粘在木塊上；這時將蠟塊固定在切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚度在5 μm之間。展片與貼片：首先將蠟帶斬為單片，再將單個蠟片放于40 ℃的溫水中，使其展開，展平，再取一張中央涂有甘油-蛋白膠的載片伸入溫水中，將蠟片撈于載片中央，傾去多余的水份后置于干燥箱中，60 ℃條件下烘干。染色、脫水、透明：把浸于70%乙醇的組織塊加入倍量蒸餾水，兩次稀釋至蒸餾水約2 h，投入碘酸鈉蘇木精，蒸餾水分色10 h，自來水藍(lán)化3 d，蒸餾水洗1 min，70%、80%、90%乙醇逐級脫水各1 h，伊紅溶液染色2 d，90%乙醇（A）、（B）脫水與分色各1 h，100%乙醇（A）、（B）各脫水1 h，二甲苯（A）、（B）透明各1 h。封存：將已經(jīng)透明的切片從二甲苯（B）中取出，滴加樹膠，蓋上蓋玻片即可，拷干后制成永久性標(biāo)本。

（2）注意事項。組織固定：用于組織固定的材料必須新鮮，采集和分割后要立刻固定，不得延誤；固定材料體積的大小，以不超過直徑5 mm為準(zhǔn)，材料與固定液的比例，以1：20為準(zhǔn)；所用固定液以新配的為好，并放置在陰涼處，不要在日光下直曬；材料固定完畢后，必須在容器外貼上標(biāo)簽，以防止相互混淆。組織脫水：組織脫水是在低濃度乙醇中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體；在高濃度乙醇中，每級停留時間也不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；脫水應(yīng)徹底干凈，否則與二甲苯混合后，將呈乳白色渾濁，雖然可以倒回重脫，但效果不好；如需過夜，應(yīng)停留在70%乙醇中。組織塊透明：組織塊透明時要注意二甲苯極易揮發(fā)，故在切片透明之后，從染色缸中取出封藏，手續(xù)要敏捷，不宜久置，否則待二甲苯揮發(fā)干凈后，組織就會變硬發(fā)白，即使再加樹膠封藏，由于樹膠不能浸入組織，封后也無用處；二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在濕度大的天氣，貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林，以防止水分的滲入。在封片時也不宜將口鼻過分靠近切片，以免水氣侵入，出現(xiàn)白色云霧狀；二甲苯必須保持無水無酸。若用1～2滴石蠟油滴入其中，立即出現(xiàn)云霧狀，即表示其中已含有水分，不能再用。石蠟切片制作：檢驗過程中，石蠟切片制作出現(xiàn)了材料裂隙、破碎的情況，請做類似試驗時借鑒。

通過流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化、組織學(xué)觀察可以作出診斷，進(jìn)一步確診還需進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散沉淀實驗、病毒分離等方法。

1.2.3 血清學(xué)診斷（瓊脂擴(kuò)散試驗）

（1）用MD抗原檢測被檢雞血清樣本，用滴管在中央孔加入MD抗原，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別加入外周1、4孔。被檢雞血清按順序分別加入4個外周孔中，每一個被檢樣用1個滴頭。加樣完畢，蓋上平皿，做好標(biāo)記、編號，放入帶蓋濕盒中，置37 ℃溫箱內(nèi)24～48 h，觀察并做詳細(xì)記錄。

（2）用MD陽性血清檢測雞的羽髓，選拔被檢雞含羽髓的翅羽或身體其他部位的大羽（或新生羽）數(shù)根，將含有羽髓的羽根按雞的編號分別集于三分管內(nèi)，每管加2～3滴蒸餾水，用玻璃棒將羽根壓集于管底，以適當(dāng)?shù)膲毫D(zhuǎn)動玻璃棒，擠壓出羽髓后傾斜試管，用毛細(xì)管順次加到外周受檢孔中（2、3、5、6孔）。中心孔加入MD陽性血清，外周1、4孔加入標(biāo)準(zhǔn)抗原。加樣完畢，蓋上平皿，做好標(biāo)記、編號，放入帶蓋濕盒中，置37 ℃溫箱內(nèi)24～48 h，觀察并做詳細(xì)記錄。

注意事項：應(yīng)多拔幾根新羽來檢查；加樣時，以把孔加滿為度，切忌樣品溢出，影響判定結(jié)果；與鄰接孔連片時應(yīng)作廢處理；MD陽性血清避免反復(fù)凍融，以防降低效價而影響檢出結(jié)果；在瓊脂擴(kuò)散試驗時，還要注意羽囊同邊緣孔緊密吻合，防止羽囊徑小，邊緣孔大，抗原擴(kuò)散不充分，降低查檢率。

判定標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清兩孔間形成清晰的白色沉淀線。被檢材料孔與標(biāo)準(zhǔn)試劑孔間出現(xiàn)明顯的沉淀線，或標(biāo)準(zhǔn)陽性試劑間的沉淀線末端向被檢材料一側(cè)曲，判為陽性。有的被檢材料可能出現(xiàn)1條以上的沉淀線，仍判為陽性。無沉淀線則為陰性。

1.2.4 病毒學(xué)診斷（病毒分離） 分離病毒的材料，采用病雞的抗凝血，由于MDV具有高度的細(xì)胞結(jié)合性，在分離材料的處理過程中，除保持無菌條件外，還必須保持分離細(xì)胞的生理活性。

（1）雞胚接種法。試驗組：將0.1 mL的病料分別接種于10只4～5日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，分別于接種后4～6 d和10～11 d觀察絨毛尿囊膜上是否產(chǎn)生典型的皰疹病毒痘斑。對照組：將0.1 mL的抗凝劑分別接種于10只4～5日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，分別于接種后4～6 d和10～11 d觀察，與試驗組進(jìn)行對照。

（2）雛雞接種法。試驗組：選擇1日齡或1周齡的易感雞10只，將病料如病雞的抗凝血0.5 mL經(jīng)腹腔接種，然后嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)觀察，接種后18～21 d，觀察是否產(chǎn)生雞馬立克氏病的特征性病理變化。對照組：選用抗凝劑0.5 mL經(jīng)腹腔接種，同時隔離飼養(yǎng)觀察，與試驗組進(jìn)行對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢結(jié)果

在送檢的30只病死雞中，22只出現(xiàn)坐骨神經(jīng)、迷走神經(jīng)等單側(cè)性神經(jīng)腫大而變粗，呈黃白色水腫樣變化；21只出現(xiàn)肝臟腫大、質(zhì)脆，表面觀察到大小不等的白色結(jié)節(jié)；17只出現(xiàn)心外膜可見綠豆至黃豆大小的白色結(jié)節(jié)，形狀呈球形、橢園形或不規(guī)則形，結(jié)節(jié)突出于心臟表面致使心外膜凹凸不平；15只出現(xiàn)脾臟腫大，包膜緊張，切面膨隆外翻；18只出現(xiàn)腎臟腫大，前腎隆起凸入腹腔，可見大小不等的灰白色結(jié)節(jié)；22只腺胃黏膜乳頭腫脹，乳頭之間可見出血斑；23只肌胃角質(zhì)膜下觀察到線狀出血斑；16只十二指腸黏膜充血或出血病變；20只盲腸扁桃體腫脹、出血；22只泄殖腔黏膜線狀出血病變；20只法氏囊出現(xiàn)萎縮。4只無明顯剖檢病理變化。

2.2 病理組織切片結(jié)果

2.2.1.心臟 心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細(xì)胞呈浸潤性增生。肌纖維脂肪變性，局部蠟樣壞死。

2.2.2 脾臟 鞘動脈周圍、淋巴小結(jié)出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞。淋巴細(xì)胞核碎裂、邊集，并見核分裂相。

2.2.3 肝臟 肝細(xì)胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄，散在少量的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。中、小淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞在靜脈周圍浸潤。在肝小葉內(nèi)局灶性增生。增生灶內(nèi)有呈空泡狀的原始網(wǎng)狀細(xì)胞和核邊集的凋亡淋巴細(xì)胞。肝細(xì)胞壞死處有淋巴細(xì)胞集聚。

2.2.4 腎臟 腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質(zhì)。腎小囊壁上皮細(xì)胞腫脹。局部腎小球萎縮，出現(xiàn)代償性增大。腎小管上皮細(xì)胞從顆粒變性、水泡變性到細(xì)胞壞死、胞膜破裂，整個腎小管呈均質(zhì)紅染。腎小管內(nèi)有血紅蛋白樣物質(zhì)，呈尿管型。

2.2.5 坐骨神經(jīng) 神經(jīng)纖維間水腫液內(nèi)散在中小淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢 皮質(zhì)和髓質(zhì)見有結(jié)節(jié)性或彌漫性網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞集聚。淋巴細(xì)胞核顯分裂相，局灶性增生細(xì)胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態(tài)淋巴細(xì)胞所代替。

2.2.7 腺胃 腺小管腺細(xì)胞開始呈顆粒變性、水泡變性，逐漸壞死，腺小管內(nèi)散在流失的胞漿。淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤和增生。

2.2.8 十二指腸 肌層肌細(xì)胞和腸絨毛上皮細(xì)胞變性、壞死。漿膜、漿膜下肌層、腸腺間和絨毛固有層出現(xiàn)不同程度的大中小淋巴細(xì)胞浸潤和增生。腸腺間有網(wǎng)狀細(xì)胞增生。

2.2.9 肺 血管內(nèi)、外散在淋巴細(xì)胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細(xì)胞浸潤，局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細(xì)胞、少量的網(wǎng)狀細(xì)胞。肺小葉內(nèi)充滿淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞，局部實質(zhì)內(nèi)全被腫瘤細(xì)胞代替。

2.3 血清學(xué)診斷的結(jié)果

30份病料中，26份陽性，4份陰性。21份產(chǎn)生清晰可見的灰白色沉淀為陽性，5份產(chǎn)生一條以上的沉淀線，但仍屬于陽性，4份無沉淀線則為陰性。

2.4 病毒分離的結(jié)果

通過試驗組與對照組的比較，試驗組雛雞接種后可見肝、脾表面和切面均可見白色結(jié)節(jié)狀腫瘤，腎、卵巢褪色、腫大等典型雞馬立克氏病的特征性病理變化。

試驗組雞胚接種，在絨毛尿囊膜上可出現(xiàn)MDV引起典型皰疹病毒痘斑。在檢查痘斑時應(yīng)注意區(qū)別其他病原引起的類似痘斑。

通過產(chǎn)生的這種典型皰疹病毒痘斑可對雞馬立克氏病進(jìn)行確診。

3 防治措施

3.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生管理

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善雞群的生活條件，增強(qiáng)雞體的抵抗力，對預(yù)防該病有很大的作用。飼養(yǎng)管理不善、環(huán)境條件差或某些傳染病如球蟲病等常是重要的誘發(fā)因素。定期搞好雞舍尤其是出雛室和育雛舍的徹底消毒，防止雛雞的早期感染是非常重要的，否則即使出殼后即刻免疫有效疫苗，也難防止發(fā)病。

3.2 疫苗接種

目前國內(nèi)使用的疫苗有多種。按產(chǎn)地可分為進(jìn)口疫苗和國內(nèi)生產(chǎn)的疫苗。按血清型可分為三種，血清1型疫苗：主要是減弱弱毒力株CV1-988、814疫苗；血清2型疫苗：主要有SB-1、301B/1、Z4株；血清3型疫苗：即火雞皰疹病毒HVT-FC126疫苗。按疫苗所有毒株種類，可分為單價苗、二價苗和三價苗等。自20世紀(jì)80年代開始，由于出現(xiàn)了超強(qiáng)毒，單價苗免疫失敗屢屢發(fā)生，因此有些學(xué)者提出多價苗戰(zhàn)略，并先后研制出多價苗，二價或三價苗等。

4 小結(jié)

本試驗對30只病死雞進(jìn)行剖檢診斷，病理組織切片觀察，瓊脂擴(kuò)散試驗和病毒分離試驗進(jìn)行診斷。病理剖檢見坐骨神經(jīng)、迷走神經(jīng)單側(cè)性腫大以及肝臟腫大、質(zhì)脆等；光鏡下，肝組織中集聚大量淋巴樣細(xì)胞，心肌纖維間彌散大量多形性淋巴細(xì)胞；瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果為：26份陽性，4份陰性。將病料接種雛雞，雛雞均出現(xiàn)典型的雞馬立克氏病病理變化；病料雞胚接種見絨毛尿囊膜上出現(xiàn)明顯皰疹病毒痘斑；確診30只疑似病例中，有26只患有雞馬立克氏病，4只無明顯馬立克氏病的明顯癥狀。目前對該病尚無特效療法，其防治關(guān)鍵是疫苗接種并同時做好綜合防治。

參考文獻(xiàn)：

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