乙肝后肝癌發(fā)生過程中生長抑素受體演變及相關(guān)因素研究

姜明霞等

摘要：目的 希望通過研究能夠找到更好的治療方案，遏制乙肝病毒的感染，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量，增加患者的壽命。方法 利用免疫組化法和放射免疫法來分別檢測身體中的SSTR1-5蛋白表達(dá)以及SST含量，之后再利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法來進(jìn)行處理。結(jié)果 研究的40例肝癌的患者的類型都是中-低分化，而且在癌旁組織中每個患者都有不一樣的非典型增生的現(xiàn)象出現(xiàn)。結(jié)論 通過研究發(fā)現(xiàn)，肝癌前之所以會產(chǎn)生病變主要是因?yàn)楦渭?xì)胞出現(xiàn)了不典型增生的現(xiàn)象，而且不典型增生的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在癌旁組織中，對患者影響非常大。

關(guān)鍵詞：乙肝；肝癌；生長抑素受體演變；相關(guān)因素；研究

原發(fā)性肝細(xì)胞癌，英文縮寫為HCC，這種病癥在我國腫瘤患者中比較普遍，而且發(fā)病率近些年來越來越高，早已引起了醫(yī)學(xué)界的重視。在我國原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中將近九成是由于乙肝病毒引起的，再加之原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)防處理相對來說比較差，因此研究更好的治療方法無論是對患者本身，還是對醫(yī)學(xué)研究意義都十分重大。在乙肝后肝癌發(fā)生時，其生長抑素受體會發(fā)生演變，接下來，筆者就這種演變及其相關(guān)因素進(jìn)行有效的研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)研究目的選擇出5名自愿參與研究的人員，其肝組織經(jīng)過檢查并沒有任何病變；之后又選擇出14例患者，其肝組織有些許病變，屬于慢性肝炎；然后再選擇出40例患者，其肝組織病變相對嚴(yán)重，屬于肝硬化，這40例患者中有4例屬于良性肝病，已經(jīng)做完手術(shù)；最后在選擇80例患者，其肝病變主要屬于肝癌癌旁組織以及肝癌組織，這些患者的年齡范圍闊度比較大，21～79歲。這些患者都是來自于一個醫(yī)生，這樣便于研究，因?yàn)獒t(yī)生比較清楚每位患者的情況。

1.2主要試劑 主要試劑有以下幾種：①RNA樣品儲存液以及提取試劑；②特異性引物；③試劑盒，要準(zhǔn)備很多種類的試劑盒，每一種類的試劑盒的作用不同，因此在研究時，要做好標(biāo)簽，以免發(fā)生事故，其中最主要的試劑盒有生長抑素放免試劑盒以及濃縮型DAB試劑盒。

上述選擇的試劑一定要確保質(zhì)量，無污染，要出自正規(guī)的企業(yè)，在試劑進(jìn)入實(shí)驗(yàn)之前，就要做好全面的檢測，確保不出現(xiàn)任何的意外情況，否則不僅影響研究結(jié)果，還會造成嚴(yán)重的后果。

1.3方法

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)檢測SSTR1-5亞型mRNA的表達(dá)取手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本組織存儲于RNA儲存液中，-20℃凍存?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明步驟，用TRIZOLReagent提取總RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。將提取的RNA溶于0.1%DEPC去離子水中，核酸蛋白定量儀（BloRADsmartSPec丁M3000）檢測RNA純度及定量，OD值）1.8的標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2免疫組化法檢測SSTR1-5蛋白表達(dá)取手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本組織，以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片備用。組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后；高壓鍋中抗原修復(fù)3min；按內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒說明操作阻斷內(nèi)源性生物素；3%水：阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶15min；非免疫源性血清封閉I0min；加一抗工作液（SSTR1-5濃度均為1：300） 孵育4℃過夜；生物素化二抗37℃孵育15min；過氧化氫酶標(biāo)記的親和素孵育5min；現(xiàn)配DAB試劑，顯影5～10min，棕褐色染色為陽性，鏡下觀察終止反應(yīng)；蘇木精染色smin，鹽酸一酒精分化5s，碳酸鏗反藍(lán)lmin；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片；01五廠隊(duì)USBX41儀器照相。

實(shí)驗(yàn)以手術(shù)切除的人小腸組織為陽性對照，以PBS替代一抗為空白對照。陽性表達(dá)強(qiáng)度以陽性染色光密度值（IOD值）表示，在400倍放大條件下，每張切片隨機(jī)取5個視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，Image-ProPlus4.5軟件定量測定陽性染色I(xiàn)OD值，取均值為該標(biāo)本的IOD值；每高倍鏡（400×）視野<5個陽性細(xì)胞判斷為陰性。

1.3.3放射免疫法（Radioimmunoassa乳班A）檢測SST含量：取新鮮組織標(biāo)本-80℃凍存?zhèn)溆?；取組織塊，稱重200mg，加2ml生理鹽水100℃煮沸3min，加入0.1N鹽酸0.5ml，剪碎后，超聲勻漿器勻漿；4℃孵育1～2h，加0.1N NaoH0.5ml中和；4℃低溫離心3000rpm×30min，取上清液；考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，蛋白液-20℃凍存待檢。放射免疫分析檢測按SST放免試劑盒操作說明進(jìn)行。放免檢測分析儀自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算和打印檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1從研究中能夠得出肝組織病理，40例肝癌患者中干細(xì)胞都或多或少的存在著非典型性增生的現(xiàn)象，選擇的五種標(biāo)本中，其肝癌組織特征各有不同，其中主要表現(xiàn)在PCR體系以及PT反應(yīng)體系中。

2.2在五種肝組織標(biāo)本中都可以檢測出SSTR1-5mRN，其中最重要的發(fā)現(xiàn)就是RT-PCR的同源性非常高，甚至達(dá)到了100%。比如SSTR1預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度是303bp，而實(shí)際測序長度是305bp，其同源性是96%；而SSTR2預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度與實(shí)際測序長度相同都是390bp，其同源性高達(dá)100%；而SSTR3、SSTR4的預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度與實(shí)際測序長度只差1bp，其同源性都達(dá)到了99%；而SSTR5預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度是385bp，實(shí)際測序長度是388bp，其同源性達(dá)到了96%。

2.3從研究中可以發(fā)現(xiàn)在這五種肝組織標(biāo)本中SSTR1-5的蛋白表達(dá)量與SST含量成正比，也就是SSTR1-5的蛋白表達(dá)量越高，其SST含量也就越高，反之亦然。其具體表現(xiàn)如下：從選擇的5名正常肝組織人員中SSTR1-5的蛋白表達(dá)量我們已經(jīng)通過上述的闡述已經(jīng)知道，與之相對應(yīng)的SST含量都在16.2上下浮動2.4；14例慢性肝炎組織患者的SST含量都在78.3上下浮動14.1；而40例肝硬化組織患者的SST含量都在140.6上下浮動30.4；40名旁組織患者的SST含量都在618.1上下浮動129.4；40例肝癌組織患者的SST含量都在352.8上下浮動74.4。

3 討論

從上述的試驗(yàn)中，我們可以總結(jié)出乙肝后肝癌發(fā)生過程中生長抑素受體演變的基本過程主要有5個步驟，第一是正常肝臟，但是如果沒有保護(hù)好，肝臟會發(fā)生病變進(jìn)而變成慢性肝炎，如果不及時治療最終會形成肝硬化，到達(dá)這一程度后，肝臟就會發(fā)生癌前病變，這一階段已經(jīng)非常危險，如果不能及時的救治，而是放任不管，就會形成HCC，也就是原發(fā)性肝癌。從這一演變過程中，我們可以知道，肝臟如果不是天生因素，發(fā)生病變的原因主要都是由于人們自身沒有保護(hù)肝臟的意識。

通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝臟已經(jīng)屬于癌前病變時，最顯著的特征就是干細(xì)胞出現(xiàn)了不典型增生的現(xiàn)象，而且這種不典型增生通常長在癌旁組織中，本文研究所選擇的癌前病變患者中，其癌旁組織都存在著這種不典型增生的現(xiàn)象。

通過大量的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SST對很多種類的細(xì)胞的增值都有產(chǎn)生一種非常明顯的抑制作用，如果肝細(xì)胞所處的環(huán)境非常好，而且沒有其他病理因素的影響，通常情況下是不會出現(xiàn)增生現(xiàn)象，但是從慢性肝炎一直到肝癌這幾個階段，肝細(xì)胞就會逐漸的出現(xiàn)增生的現(xiàn)象。

SST之所以能夠?qū)?xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，主要是因?yàn)樗鼘儆谟H水性多肽，能夠?qū)⒓?xì)胞膜中的SSTRs有效的激活，通過一系列生物學(xué)上的反映，進(jìn)而起到抑制的作用。從研究中發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的細(xì)胞如果出現(xiàn)了癌變現(xiàn)象，其SSTRs其增長速度非?？?，而SST與之相結(jié)合之后，就會使受體出現(xiàn)活化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)象，一般在這種情況下，是不需要SST融入其中的，但是因?yàn)樾盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)非常有可能會出現(xiàn)中止的現(xiàn)象，因此還是需要SST與之相結(jié)合。

通過實(shí)驗(yàn)可以總結(jié)出，人的肝臟一旦出現(xiàn)癌變，在其發(fā)展過程中，SST與SSTRs兩者是平行的關(guān)系，在細(xì)胞增殖的過程中，不僅SST起到了抑制的作用，SSTRs也同樣幫助SST起到了一直細(xì)胞增殖的作用。癌旁肝細(xì)胞SSTRs聚集在靠近門靜脈方向的細(xì)胞膜，從單個細(xì)胞看，這一方位的SST-SSTRs復(fù)合物胞吞現(xiàn)象也分外突出，進(jìn)一步反映了癌前病變期的肝細(xì)胞正通過SST-SSTRS元件以最大的努力調(diào)整自身增殖異常。結(jié)果提示，SSTA不僅有用于治療失去手術(shù)機(jī)會HCC患者的分子作用基礎(chǔ)，還適用于術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)防。在肝內(nèi)門靜脈上皮及部分膽管上皮細(xì)胞檢測到的SSTRS僅位于細(xì)胞膜，提示SSTRs的再循環(huán)不如肝細(xì)胞活躍。

從具體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)如果要對原發(fā)性肝細(xì)胞癌進(jìn)行抑制，有超過一半的患者可以使用SSTA進(jìn)行治療，而且效果十分明顯。在臨床檢測中，研究人員在對原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行檢查時也對其SSTRs進(jìn)行檢查，這種檢查的目的主要是為了選擇合適的患者，這些患者主要是通過SSTA來治療。每一種治療方法都有適當(dāng)?shù)臅r機(jī)，SSTA也不例外，其治療的最好時機(jī)是癌前發(fā)生病變的時期，所以在肝癌發(fā)生前就產(chǎn)生病變的患者，幾乎都可以利用這種方法治療，從實(shí)驗(yàn)中也看出其效果非常好，患者都得到了有效的治療，在一定程度上得到了康復(fù)，對延長壽命有一定的積極作用。

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