霍山石斛中不同多糖組分的保肝活性

田長(zhǎng)城，羅建平*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030）

?

霍山石斛中不同多糖組分的保肝活性

田長(zhǎng)城1,2，羅建平1,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030）

摘 要：采用熱水浸提和DEAE-纖維素陰離子交換法從霍山石斛中分離出4 種多糖組分（DHP1、DHP2、DHP3 和DHP4），比較了4 種多糖組分對(duì)四氯化碳（CCl4）肝毒性的保護(hù)作用。結(jié)果表明：口服DHP1顯著降低了CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的升高，削弱了肝組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)了肝組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的活性。因此，DHP1可能是霍山石斛中一種潛在的保肝多糖成分。

關(guān)鍵詞：霍山石斛；多糖；四氯化碳；肝損傷

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）是我國(guó)一種多年生的藥用草本植物，其根莖不僅可入藥，還是一種名貴的滋補(bǔ)品，具有生津養(yǎng)胃、明目護(hù)肝以及抗腫瘤等功效[1]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛中含有多糖、生物堿、酚類和各種微量元素，其中多糖的活性十分顯著，具有抗氧化[2]、免疫刺激[3]、抗糖基化[4]以及抗白內(nèi)障[5-6]等多種功能活性，受到了人們的廣泛關(guān)注。

大量的研究表明一些天然產(chǎn)物能夠增強(qiáng)肝對(duì)毒性物質(zhì)的抵抗力，呈現(xiàn)有效的保肝作用[7-8]。其中，天然多糖由于其保肝活性顯著、毒性小而備受研究者關(guān)注[9-10]。黃靜等[11]發(fā)現(xiàn)霍山石斛粗多糖能夠有效增強(qiáng)小鼠對(duì)四氯化碳（CCl4）肝損傷的抵抗能力，表現(xiàn)出顯著的保肝功效。然而，粗多糖多是通過(guò)水提醇沉的方法制備獲得，雖然富含碳水化合物，但組分十分復(fù)雜。因此，對(duì)粗多糖的進(jìn)一步分離、純化是研究多糖保肝活性的前提條件，同時(shí)也有利于進(jìn)一步理解多糖性質(zhì)與活性間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)利用DEAE-纖維素陰離子交換樹(shù)脂對(duì)霍山石斛粗多糖進(jìn)一步分離，得到4 種不同的多糖組分，比較了這4 種組分對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，期望為霍山石斛多糖進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、動(dòng)物與試劑

霍山石斛幼苗由實(shí)驗(yàn)室組培獲得。

雄性昆明小鼠（SPF級(jí)，體質(zhì)量（23±2） g）購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK 2011-002）。

DEAE-纖維素陰離子交換樹(shù)脂美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司；水飛薊素大馬士德制藥公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；傅里葉紅外波譜儀美國(guó)Nicolet公司；CT15RT冷凍離心機(jī)香港天美科技有限公司；LGJ-18S原位冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3方法

1.3.1 霍山石斛多糖的提取和分離

霍山石斛干燥后粉碎成末，浸入80%的乙醇中24 h脫除色素和小分子物質(zhì)；風(fēng)干后按料液比1∶100（m/V）加入蒸餾水，在65 ℃條件下攪拌提取2 h，過(guò)濾后，殘?jiān)匦绿崛∫淮?，合并濾液；用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，然后10 000 r/min離心10 min，向上清液中加入4 倍體積的95%乙醇，室溫過(guò)夜；醇沉物用蒸餾水溶解，采用Sevag法處理5 次，去除蛋白；經(jīng)透析和冷凍干燥后得到霍山石斛粗多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）。

取20 mg DHP溶于5 mL蒸餾水中，充分溶解后3 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)DEAE-纖維素陰離子交換層析柱（4.3 cm×40 cm）。依次用雙蒸水、0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，每種洗脫液洗脫200 mL，流速為5 mL/min，分別收集得到DHP1、DHP2、DHP3和DHP4 4 種組分。收集液濃縮后用透析袋（截留MW為3 500 D）對(duì)自來(lái)水透析24 h，適當(dāng)濃縮后冷凍干燥，精確稱質(zhì)量，計(jì)算得率。

1.3.2 多糖組分中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定各組分中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12]。

1.3.3 霍山石斛多糖的紅外波譜分析

樣品在60 ℃烘箱中干燥24 h后與KBr碾磨壓片，利用傅里葉紅外波譜儀掃描4 000～400 cm－1區(qū)間的吸收峰。

1.3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性昆明小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房中，動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵守我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成18 組（每組10 只）：對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、粗多糖及其4 個(gè)多糖組分測(cè)試組（每種多糖分別設(shè)50、100、200 mg/kg 3 個(gè)質(zhì)量濃度組）。水飛薊素是一種常見(jiàn)的保肝藥物，實(shí)驗(yàn)中被用做陽(yáng)性對(duì)照藥物（25 mg/kg）。水飛薊素和多糖組分分別溶于雙蒸水中，配成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，利用無(wú)菌注射器按10 mL/kg劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。對(duì)照組和模型組小鼠用等量的雙蒸水代替。小鼠每天灌胃1 次，連續(xù)處理14 d。最后一次灌胃后4 h時(shí)，用1.5 g/L的CCl4溶液（CCl4溶解于橄欖油中）按照10 mL/kg對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，誘發(fā)肝損傷模型。其中對(duì)照組小鼠注射等劑量的橄欖油。

CCl4注射24 h后，采用眼球摘除法收集血液，室溫下放置4 h，在3 000 r/min和4 ℃條件下離心10 min，收集血清保存在－78 ℃冰箱中，備用。采用頸椎脫臼法處死小鼠后進(jìn)行解剖，迅速取出肝，在生理鹽水中洗去血液，濾紙吸去水分。肝的左小葉用10%福爾馬林固定液浸泡，其余部分迅速用液氮冷凍，置于－78 ℃冰箱中，備用。

1.3.5 血清中ALT和AST活性的測(cè)定

利用生化試劑盒中說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定血清中ALT和AST的活性。

1.3.6 肝組織中MDA含量和SOD、CAT活性的測(cè)定

取1.0 g小鼠的肝組織，置于勻漿機(jī)中，加入9 mL的預(yù)冷勻漿溶液（0.01 mol/L蔗糖、0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diaminetetraacetic acid disodiumsalt，EDTA-2Na）溶液，pH 7.4），充分研磨。在4 ℃和3 000 r/min條件下離心10 min，用移液槍吸取上清液，保存在低溫冰箱中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法測(cè)定上清液中MDA含量和SOD、CAT活性。

1.3.7 肝組織病理學(xué)觀察

取出固定液中的肝組織，自來(lái)水沖洗后依次在體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和95%的乙醇溶液中進(jìn)行脫水，二甲苯透明化后，石蠟包埋切片（5 μm），伊紅-蘇木精（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1霍山石斛粗多糖的分離

采用水提醇沉的方法提取出霍山石斛中的粗多糖（DHP），其得率為干霍山石斛質(zhì)量的4.25%。利用DEAE-纖維素陰離子交換樹(shù)脂將DHP進(jìn)一步分成了4 種不同的組分，其中DHP1為中性多糖（水洗組分），呈白色粉末狀，得率為3.17%；DHP2、DHP3和DHP4為弱酸性多糖（鹽洗），呈淺褐色，得率分別為0.51%、0.24%和0.21%。

利用苯酚-硫酸法測(cè)定了不同多糖組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中DHP1中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.5%，而DHP2、DHP3和DHP4的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42%、45%和42%，表明中性多糖是霍山石斛粗多糖中的主要多糖組分，而其他3 種酸性多糖則含有大量的雜質(zhì)。

2.2不同多糖組分的紅外波譜分析

圖1　不同霍山石斛多糖組分的紅外波譜Fig.1 Infrared spectra of different polysaccharides from D. huoshanense

利用紅外波譜驗(yàn)證4 種多糖組分的特征。由圖1可知，4 種組分在3 380 cm－1和2 925 cm－1處均存在明顯的吸收峰，分別表示羥基O—H鍵的伸縮振動(dòng)和C—H的吸收峰。此外，1 640 cm－1處的吸收峰表明組分中含有一定量的結(jié)合水[13]。紅外波譜中850～1 200 cm－1處的吸收峰被認(rèn)為是多糖的“指紋區(qū)”，多糖間的差異很大。DHP1 在850 cm－1和930 cm－1處存在著吸收峰，表明它具有α構(gòu)型的葡萄糖；而DHP2、DHP3和DHP4在890 cm－1處具有吸收峰，這說(shuō)明它們的單糖為β構(gòu)型[14]。DHP3和DHP4紅外波譜1 730 cm－1和1 245 cm－1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)著酯鍵中C＝O和C—O鍵的伸縮振動(dòng)，表明可能存在羧基。

2.3不同多糖組分的保肝活性

圖2　不同霍山石斛多糖的保肝作用Fig.2 Hepatoprotective effects of different polysaccharides from D. huoshanense

ALT和AST是肝細(xì)胞內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶，常用做評(píng)價(jià)肝細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，CCl4的注入使小鼠血清中ALT和AST的水平分別增加了8.0、2.2 倍，表明肝損傷模型的成功建立。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了霍山石斛粗多糖（DHP）的保肝活性，并進(jìn)一步對(duì)4 種多糖組分的保肝活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由圖2可知，DHP1的預(yù)處理有效地削弱了CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT和AST水平的升高，而其他3 種多糖組分的效果則不明顯。

圖3　小鼠肝組織的病理變化Fig.3 Pathological changes of liver tissues

圖3是不同處理組小鼠肝組織的切片，CCl4的處理造成了肝組織大面積的空泡化和壞死，而DHP和DHP1的預(yù)處理則顯著降低了這種病理的改變，進(jìn)一步證明了它們的保肝功效。

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷是一種典型的氧化型組織損傷，其進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被細(xì)胞色素P450酶代謝生成三氯甲基自由基（·CCl3）和三氯甲基過(guò)氧自由基（·OOCCl3），從而導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激[17]。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，它一定程度上反映了肝細(xì)胞的氧化損傷程度[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，DHP和DHP1可以有效地降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織中MDA含量的升高，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系（圖4）。

圖4　不同處理組小鼠肝組織中的MDA水平Fig.4 MDA levels in liver tissues from different treatment groups

圖5　不同處理組小鼠肝組織中SOD和CAT活力Fig.5 Levels of SOD and CAT in liver tissues from different treatment groups

SOD和CAT是生物體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶，在清除動(dòng)、植物體內(nèi)自由基過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[20-22]。由圖5可知，在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中，肝組織中SOD和CAT的活性顯著低于正常水平，間接加劇了組織的氧化應(yīng)激。DHP1（200 mg/kg）的預(yù)處理使SOD 和CAT的活力分別增至（259.10±15.88） U/mg pro和（135.38±25.81） U/g pro，顯著高于模型組。

3　結(jié) 論

本研究重點(diǎn)比較了霍山石斛中不同多糖組分的保肝活性，結(jié)果表明：霍山石斛粗多糖中含有大量的中性多糖（DHP1）和一定量的酸性多糖。DHP1中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.5%，口服DHP1可以有效抑制CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的升高，降低肝組織中丙二醛的產(chǎn)生，同時(shí)恢復(fù)了肝細(xì)胞中SOD和CAT的活性，是霍山石斛中一種有效的保肝多糖成分。之前的研究發(fā)現(xiàn)，DHP1中富含甘露糖、葡萄糖和半乳糖[23-24]，它的這種保肝活性可能與其結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]包雪聲, 順慶生, 陳立鉆. 中國(guó)藥用石斛: 彩色圖譜[M]. 上海: 上海醫(yī)科大學(xué)出版社, 2001: 1-90.

[2]郝杰, 查學(xué)強(qiáng), 鮑素華, 等. 霍山石斛不同分子量多糖體外抗氧化研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(15): 94-98.

[3]HSIEH Y S Y, CHIEN C, LIAO S K S, et al. Structure and bioactivity of the polysaccharides in medicinal plant Dendrobium huoshanense[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(11): 6054-6068.

[4]ZHA Xueqiang, LI Xiaolong, ZHANG Hailin, et al. Pectinase hydrolysis of Dendrobium huoshanense polysaccharide and its effect on protein nonenzymatic glycation[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 61: 439-447.

[5]LUO Jianping, DENG Yuanyuan, ZHA Xueqiang. Mechanism of polysaccharides from Dendrobium huoshanense on streptozotocininduced diabetic cataract[J]. Pharmaceutical Biology, 2008, 46(4): 243-249.

[6]李秀芳, 鄧媛元, 潘利華, 等. 霍山石斛多糖對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠眼球晶狀體組織抗氧化作用的研究[J]. 中成藥, 2012, 34(3): 418-421.

[7]CHO B O, RYU H W, SO Y, et al. Hepatoprotective effect of 2,3-dehydrosilybin on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 107-115.

[8]AKACHI T, SHIINA Y, OHISHI Y, et al. Hepatoprotective effects of flavonoids from shekwasha (Citrus depressa) against D-galactosamineinduced liver injury in rats[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2010, 56(1): 60-67.

[9]SHIM J Y, KIM M H, KIM H D, et al. Protective action of the immunomodulator ginsan against carbon tetrachloride-induced liver injury via control of oxidative stress and the inflammatory response[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2010, 242(3): 318-325.

[10]CHARLES A L, HUANG T C. Sweet cassava polysaccharide extracts protects against CCl4liver injury in Wistar rats[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(6): 1494-1500.

[11]黃靜, 李勝立, 趙宏偉, 等. 霍山石斛多糖對(duì)四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(4): 528-532.

[12]DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[13]LI Qiang, XIE Yang, SU Jianwei, et al. Isolation and structural characterization of a neutral polysaccharide from the stems of Dendrobium densiflorum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50: 1207-1211.

[14]CUI Hengxiang, LIU Qin, TAO Yongzhen, et al. Structure and chain conformation of a (1→6)-α-D-glucan from the root of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi and the antioxidant activity of its sulfated derivative[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 74(4): 771-778.

[15]RECKNAGEL R O, GLENDE J E A, DOLAK J A, et al. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity[J]. Pharmacology & Therapeutics, 1989, 43(1): 139-154.

[16]姚秀芬, 程棟, 王承明. 花生粗多糖對(duì)四氯化碳及酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9): 261-265.

[17]TANIGUCHI M, TAKEUCHI T, NAKATSUKA R, et al. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride[J]. Life Sciences, 2004, 75(13): 1539-1549.

[18]BEDDOWES E J, FAUX S P, CHIPMAN J K. Chloroform, carbon tetrachloride and glutathione depletion induce secondary genotoxicity in liver cells via oxidative stress[J]. Toxicology, 2003, 187(2): 101-115.

[19]XU Hongli, GUO Tingting, GUO Yifeng, et al. Characterization and protection on acute liver injury of a polysaccharide MP-I from Mytilus coruscus[J]. Glycobiology, 2008, 18(1): 97-103.

[20]HUNG M Y, FU T Y C, SHIP P H, et al. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(8): 1424-1431.

[21]繆燦銘, 安輝, 黃國(guó)強(qiáng), 等. 益氣化瘀對(duì)缺血再灌注大鼠血清心肌酶、超氧化物歧化酶及丙二醛的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2013, 24(6): 585-587.

[22]王楊科, 路宏朝, 王琦. 鎘對(duì)泥鰍肝臟及其過(guò)氧化氫酶的影響[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(4): 52-55.

[23]ZHA Xueqiang, LUO Jianping, LUO Shuizhong, et al. Structure identification of a new immunostimulating polysaccharide from the stems of Dendrobium huoshanense[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 69(1): 86-93.

[24]吳胡琦. 霍山石斛組織快繁中不同發(fā)育階段多糖品質(zhì)的研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2010: 19-21.

Hepatoprotective Effects of Different Polysaccharides from Dendrobium huoshanense

TIAN Changcheng1,2, LUO Jianping1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Department of Biology and Food Engineering, Bengbu University, Bengbu 233030, China)

Abstract:Four polysaccharides (DHP1, DHP2, DHP3 and DHP4) were isolated and purified from young seedlings of Dendrobium huoshanense by hot water extraction and DEAE cellulose anion exchange chromatography. The objective of this study was to investigate the protective e ffects of the four polysaccharides on carbon tetrachloride (CCl4)-induced acute liver injury in mice. The results showed that oral administration of DHP1 significantly decreased the levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), reduced the content of hepatic malondialdehyde (MDA) and restored the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the CCl4-treated mice, suggesting that DHP1 is a potential hepatoprotective compound in D. huoshanense.

Key words:Dendrobium huoshanense; polysaccharide; carbon tetrachloride; liver injury

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507030

中圖分類號(hào)：TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0162-05

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：田長(zhǎng)城（1980—），男，講師，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：tianchangcheng2006@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21006019）；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（12010402088 ）

收稿日期：2014-06-22