電針對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

鄭彩霞，韓肖華，黃曉琳，郭雅碧

國際阿爾茨海默氏病聯(lián)盟(Alzheimer's Disease International,ADI)統(tǒng)計表明：截止2013年，全世界范圍內癡呆患者達到4 440萬，預計到2050年，癡呆患者將超過13 550萬。血管性癡呆(vascular dementia,VaD)占癡呆總數(shù)的20%～30%，是僅次于阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的第2大癡呆類型[1]。針灸作為替代療法對VaD的改善作用在中西方已經(jīng)得到越來越多的實驗證實[2-3]，但其具體機制尚不明確。韓肖華等[4]發(fā)現(xiàn)電針(electroacupuncture,EA)刺激百會穴和大椎穴7d可促進腦缺血大鼠海馬蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(protein kinase A-cAMP response element binding protein,PKA-CREB)信號通路激活，使磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein,pCREB)和Bcl-2蛋白量升高，Bax蛋白量下降，Morris水迷宮成績提高。在以上研究基礎上，本實驗設置術后7d、14d、21d 3個時間點，通過延長觀察時間，進一步探討電針對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響及可能內在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：SPF(Specefic pathogen Free)級成年SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠90只，體質量250±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(許可證號：SCXK(湘)2011-0003)。②主要試劑：PKA選擇性抑制劑H89(Sigma公司)、TUNEL試劑盒(Roche公司)、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)、兔抗大鼠Bax單克隆抗體(Abcam公司)、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(Abcam公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(KPL公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術公司)。③主要材料與儀器：PVDF膜(Millipore公司)，電針儀(上海G6805-II型)、毫針(華佗牌，30號)、腦立體定位儀、微量注射器、尼康E100型生物顯微鏡、佳能600D相機。

1.2 方法 ①分組及處理：90只大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、電針組、電針+H89組和電針+NS組各18只，每組又分成7d、14d、21d 3個亞組(n=6)，每組其中3只新鮮取材后用于Western blotting檢測，另外3只灌注后用于原位末端轉移酶標記技術(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)檢測。②側腦室注射：電針+H89組和電針+NS組大鼠分別側腦室注射H89(2μg/μL)或NS 10 μL后再制作腦缺血模型。側腦室定位坐標：前囟后0.8mm，前囟右側1.5mm，硬腦膜下約4.0mm。第14d、21d組大鼠每間隔1周重復側腦室注射H89或NS一次。③造模：制備雙側頸總動脈永久性結扎(2-vessel occlusion,2VO)模型：鈍性分離頸總動脈后分別結扎近端和遠端并剪斷中部；假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈但不接扎和剪斷。④電針治療：電針組、電針+H89組和電針+NS組大鼠于造模次日開始接受電針治療。參照《實驗針灸學》[5]，“百會”穴位于頂骨正中，“大椎”穴位于背部正中第7頸椎與第1胸椎間。用針灸毫針斜刺入“百會”1cm， 直刺入“大椎”0.5cm后連接上海G6805-II型電針儀，“百會”接負極，“大椎”接正極，選取連續(xù)波，頻率20Hz，強度以觀察到大鼠眼瞼輕微顫動為宜，每天1次，每次20min，根據(jù)分組分別連續(xù)治療7d、14d或21d。假手術組及模型組大鼠術后常規(guī)飼養(yǎng)，無其他特殊處理。

1.3 評定標準 ①組織切片：10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后，經(jīng)心臟依次快速灌注生理鹽水250ml及4%多聚甲醛250ml，斷頭取腦后置于4%多聚甲醛中后固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋。按照《大鼠腦立體定位圖譜》在海馬典型位置連續(xù)冠狀切片(厚度4μm)[6]，每間隔12μm留取1張切片，每個腦組織取3張切片用于TUNEL檢測。②TUNEL檢測：實驗步驟按照試劑盒說明書操作。在400倍光學顯微鏡下，每張切片分別拍攝雙側海馬CA1區(qū)，每側CA1區(qū)隨機選取2個視野拍照。采用Image-Pro Plus軟件計數(shù)各視野下凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，并計算凋亡細胞所占比率，以上述4個視野下凋亡細胞率的均值作為該大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細胞率的值。③蛋白免疫印跡(Western blotting)：10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后，直接斷頭取腦并迅速分離出海馬組織。取1/2海馬組織塊與裂解液混合并勻漿，離心(4℃，14000g，20min)后，提取總蛋白液。上樣量60μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)(濃縮80V 30min；分離120V 90min)和轉膜(200mA 70min)，再先后孵育一抗(1∶2000，4℃，12h)和二抗(1∶10000，室溫，2h)；經(jīng)X膠片曝光顯像，采用Image-J軟件分析目標蛋白及內參蛋白的灰度值并計算比值。

2 結果

各組大鼠組內3個時間點間的海馬神經(jīng)元凋亡率相比，模型組14d組、21d組較7d組顯著增加(P<0.05)；其余各組各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。凋亡相關蛋白表達量比較，電針組21d組較14d組Bcl-2蛋白量顯著增多(P<0.05)。其余各組各個評價指標在3個時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義。同時間點各組大鼠間海馬神經(jīng)元凋亡率比較，模型組較假手術組均顯著增加(P<0.05)；電針組較模型組均顯著降低(P<0.05)；電針+H89組較電針+NS組均顯著增多(P<0.05)。同時間點各組大鼠間的凋亡相關蛋白表達量比較，模型組較假手術組Bax蛋白量均顯著增高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量均顯著降低(P<0.05)；電針組較模型組Bax蛋白量均顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量均顯著增加(P<0.05)；電針+H89組較電針+NS組Bax蛋白量均明顯增多(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量明顯降低(P<0.05)，但在14d時2組Bcl-2蛋白表達差異無顯著統(tǒng)計學意義。見圖1及表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Bax蛋白、Bcl-2蛋白的表達

a.假手術組；b.模型組；c.電針組；d.電針+H89組；e.電針+NS組

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Bax蛋白相對表達量、Bcl-2蛋白相對表達量比較

與同組7d比較，aP<0.05；與同組14d比較，bP<0.05；與同時間點假手術組比較，cP<0.05；與同時間點模型組比較，dP<0.05；與同時間點電針+NS組比較，eP<0.05

3 討論

慢性腦低灌注是VaD和AD患者發(fā)生認知功能下降的基本發(fā)病機制之一[7]，大鼠2VO模型常用于模擬人類大腦慢性低灌注病變。在該模型中，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失隨缺血時間延長逐漸加重，在術后2周[8]、4周[8]和8～13周[9]，分別有6%～29%、55%和67%的大鼠出現(xiàn)海馬結構破壞，這與本實驗中模型組7d、14d、21d神經(jīng)元凋亡率逐漸加重的結果相一致。腦缺血后機體PKA-CREB信號通路可被激活[2]，可通過調控多種靶基因的轉錄而力圖減輕腦缺血缺氧引起的神經(jīng)功能失穩(wěn)和認知功能下降，其中Bcl-2[10]、BDNF等基因與神經(jīng)元存活密切相關[10-11]。Bcl-2蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內主要的抗凋亡蛋白，而Bax蛋白會促進凋亡[12]。在本實驗中，3個時間點模型組與假手術組相比，Bax蛋白量顯著升高，伴有Bcl-2蛋白量顯著降低，可能是模型組海馬CA1區(qū)海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高的內在機制之一。

電針具有抗腦缺血后細胞凋亡的作用。陶靜等[13]研究表明電針可抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bax蛋白表達，提高Bcl-2、BDNF蛋白表達，加速神經(jīng)功能恢復。余茜等[14]研究表明電針可上調右側大腦中動脈缺血模型大鼠海馬Bcl-2蛋白表達、下調Bax蛋白表達而促進腦梗死大鼠行為能力恢復。本實驗結果中，電針組較模型組神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白量均顯著下降，同時Bcl-2蛋白量均顯著升高，提示電針可以明顯改善腦缺血后神經(jīng)元凋亡反應。但同時，分別電針治療7d、14d、21d 的三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率仍然呈增加的趨勢，分析可能原因：持續(xù)性腦流量下降發(fā)生15～20min后神經(jīng)元開始發(fā)生不可逆性損傷[15]，并且隨缺血缺氧時間延長神經(jīng)元病變范圍和程度會進行性加重，盡管電針組較同時間點模型組凋亡進展的嚴重程度已經(jīng)顯著緩解，但并不能逆轉或者完全遏制凋亡反應逐漸加重的趨勢。同時我們還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白量在電針組21d組較14d組顯著增加，提示增加電針療程可能對神經(jīng)元的保護作用更明顯。

H89是蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的選擇性抑制劑，在電針治療前側腦室注射H89組與NS組的大鼠相比，神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白表達均顯著增加，伴有Bcl-2蛋白表達顯著下降，說明電針的抗神經(jīng)元凋亡作用被抑制，反向驗證了電針的內在機制之一可能與激活PKA-CREB通路相關。電針+H89組與電針+NS組在14d時Bcl-2蛋白量無顯著統(tǒng)計學差異，可能有以下原因：①多種激酶[如Ca2+/鈣調蛋白激酶IV(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV,CaMK IV)]都能磷酸化CREB[16]，當CaMK IV激活CREB后也可以調控Bcl-2基因的表達，此時H89不能阻斷其他激酶對CREB及Bcl-2基因的作用；②后續(xù)如果增加14d、21d組的樣本量，實驗結果可能更有說服性。

綜上所述，電針刺激百會穴和大椎穴7d、14d和21d均可以明顯減輕腦缺血后海馬神經(jīng)元凋亡，其內在機制可能與激活PKA-CREB信號通路后調節(jié)Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達相關。本研究結果提示PKA-CREB信號通路可能是電針的作用機制之一，但電針是否影響該信號通路上其他基因的調控有待進一步研究。

[1] Gorelick PB,Nyenhuis D. Understanding and treating vascular cognitive impairment[J]. Continuum (Minneap Minn),2013,19(2): 425-437.

[2] Shi GX,Liu CZ,Guan W,et al. Effects of acupuncture on Chinese medicine syndromes of vascular dementia[J]. Chin J Integr Med,2014,20(9): 661-666.

[3] Chou P,Chu H,Lin JG. Effects of electroacupuncture treatment on impaired cognition and quality of life in Taiwanese stroke patients[J]. J Altern Complement Med,2009,15(10): 1067-1073.

[4] Han X,Zhao X,Lu M,et al. Electroacupuncture Ameliorates Learning and Memory via Activation of the CREB Signaling Pathway in the Hippocampus to Attenuate Apoptosis after Cerebral Hypoperfusion[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013: 156489-156489.

[5] 林文注，王佩. 實驗針灸學[M]. 上海:上?？茖W技術出版社,1994,286-286.

[6] 諸葛啟釧. 大鼠腦立體定位圖譜[M].(第3版),北京:人民衛(wèi)生出版社,2005，101-108.

[7] Yang Z,Cheng XG. From chronic cerebral hypoperfusion to Alzheimer-like brain pathology and neurodegeneration[J]. Cell Mol Neurobiol,2015,35(1):101-110.

[8] Farkas E,Luiten PG,Bari F. Permanent,bilateral common carotid artery occlusion in the rat: a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev,2007,54(1): 162-180.

[9] Liu J,Jin DZ,Xiao L,et al. Paeoniflorin attenuates chronic cerebral hypoperfusion-induced learning dysfunction and brain damage in rats[J]. Brain Res,2006,1089(1): 162-170.

[10] Mayr B,Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB [J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(8): 599-609.

[11] Zhao Y,Xiao M,He W,et al. Minocycline upregulates cyclic AMP response element binding protein and brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus of cerebral ischemia rats and improves behavioral deficits[J]. Neuropsychiatr Dis Treat,2015,11:507-516.

[12] Martinou JC,Youle RJ. Mitochondria in apoptosis: Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J]. Dev Cell,2011,21(1): 92-101.

[13] 陶靜，陳阿貞，蘭嵐，等. 電針對大鼠早期局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡機制的研究[J]. 中國康復醫(yī)學雜志,2014,29(1): 3-8.

[14] 余茜，李曉紅，黃林. 電針對腦梗死大鼠行為能力及海馬CA1區(qū)凋亡相關基因B細胞淋巴瘤/白血病基因-2、細胞凋亡通路蛋白X表達的影響[J]. 中華物理醫(yī)學與康復雜志,2012,34(4): 245-249.

[15] Sekhon LH,Spence I,Morgan MK,et al. Chronic cerebral hypoperfusion in the rat: temporal delineation of effects and the in vitro ischemic threshold[J]. Brain Res,1995,704(1): 107-111.

[16] Bell KF,Bent RJ,Meese-Tamuri S,et al. Calmodulin kinase IV-dependent CREB activation is required for neuroprotection via NMDA receptor-PSD95 disruption[J]. J Neurochem,2013,126(2): 274-287.