焦磷酸測序用于COL1A1基因多態(tài)性與骨肉瘤易感性關(guān)系分析

顏茂華 許斌 趙立來 朱求亮 羅建民 楊正明

[摘要] 目的 觀察骨肉瘤患者Ⅰ型膠原α1（COL1A1）基因多態(tài)性，探討骨肉瘤與COL1A1基因多態(tài)性的相關(guān)性。 方法 收集骨肉瘤以及正?；颊咄庵苎獦颖?，應(yīng)用焦磷酸測序方法（Pyrosequencing）對54例骨肉瘤患者與126例健康對照者COL1A1基因rs1061970位點進行分析。 結(jié)果 54例骨肉瘤患者COL1A1rs1061970位點基因型頻率中，TT（13.0%）和CT（48.1%）要顯著高于正常對照組TT基因型頻率11.9%及CT等位基因頻率30.2%（P<0.05），骨肉瘤患者組中T等位基因的頻率為37.0%，高于對照組的27.0%，OR為1.59，95%CI 0.99～2.57，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但是骨肉瘤的發(fā)病風(fēng)險仍呈上升趨勢。 結(jié)論 COL1A1基因多態(tài)性與骨肉瘤的發(fā)生具有相關(guān)性，攜帶COL1A基因T等位基因的發(fā)生骨肉瘤的風(fēng)險增高。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤；Ⅰ型膠原；基因多態(tài)性

[中圖分類號] R966；R979.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）03-0019-04

骨肉瘤作為好發(fā)于青少年的惡性腫瘤，手術(shù)方法多為廣泛切除或者截肢，導(dǎo)致致殘致畸，患者后續(xù)生活質(zhì)量較差，故而早期預(yù)警、診斷以及治療變得異常重要。近年研究結(jié)果顯示，膠原在骨組織中除了對結(jié)構(gòu)蛋白起到支持作用外，還可以深刻影響骨細胞的分化[1]、增殖[1]、粘附[2，3]以及形態(tài)發(fā)生[4]，而且和癌細胞的骨轉(zhuǎn)移也息息相關(guān)[5-7]。正常的骨組織中，90%的骨基質(zhì)由Ⅰ性膠原構(gòu)成，而軟骨中以Ⅱ型膠原為主。骨肉瘤發(fā)生時候，膠原的含量以及類型的變化可能影響骨肉瘤的分類、分化以及預(yù)后，有研究顯示[8]，Ⅰ型膠原的表達在不同分化水平的骨肉瘤中表達有顯著差異，因此，可作為骨肉瘤分化以及惡性程度判斷的參考標準。Ⅰ型膠原α1（COL1A1）基因主要編碼Ⅰ型膠原的α1鏈，是構(gòu)成3股螺旋鏈不可或缺的一部分。該基因啟動子和UTR區(qū)域具有單核苷酸多態(tài)性（SNP），某些位點的SNP不僅引起單核苷酸堿基的改變，最后可導(dǎo)致蛋白表達和構(gòu)象變化，這種變化目前已被證實可能與許多疾病密切相關(guān)，比如高度近視[9]、肝纖維化[10]、骨礦物質(zhì)密度和礦物質(zhì)轉(zhuǎn)換[11]以及椎間盤疾病[12]。骨肉瘤作為結(jié)締組織病的一種，相關(guān)的風(fēng)險基因尚缺少系統(tǒng)研究，因此，對COL1A1基因多態(tài)性與骨肉瘤易感性關(guān)系的研究，將有助于更好地為提示患者患病風(fēng)險提供預(yù)警。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于2008年1月～2013年12月期間，收集研究對象血液或石蠟切片。126例健康對照者來自我院體檢中心，其中男80例，女46例，年齡（25±10）歲。54例骨肉瘤患者來自我院骨科病房，其中男39例，女15例，年齡7～35歲，平均（20±10）歲，兩組患者年齡和性別的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。骨肉瘤患者組納入標準為經(jīng)過臨床、影像及病理學(xué)（穿刺或者組織活檢）確診為骨肉瘤；排除標準：有遺傳性腫瘤綜合征史。病理類型：骨母細胞、軟骨母細胞亞型 39例，纖維母細胞型及混合型 15例；腫瘤位置：上肢骨 16例，下肢骨 38例；Enneking GTM分期：ⅠA、ⅠB期 9例，ⅡA、ⅡB、Ⅲ期 45例；轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移 14例，無轉(zhuǎn)移 40例；治療方式：截肢 18例，保肢36例。

1.2 DNA提取

每例研究對象取外周靜脈血4 mL或者取其石蠟組織切片。全血使用2%EDTA抗凝，運輸至實驗室后，常規(guī)苯酚-氯仿法提取DNA，所取DNA溶于TE溶液，檢測純度和含量。取部分DNA模板4℃冰箱保存?zhèn)溆茫溆嗟姆盅b后-20℃凍存，石蠟包埋樣本利用Qiagen公司QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒中提取說明進行，切片厚度在5 μm以上。

1.3 基因多態(tài)性檢測

COL1A1基因SNP檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合焦磷酸測序（PCR-Pyrosequencing）方法進行COL1A1基因型檢測，COL1A1 rs1061970基因型，擴增含該多態(tài)位點的PCR引物序列為5′-TGT TCC TTT TTG TTC AAA GTC TAT-3′和biotin-5′-AAA ATT CAC AAG TCC CCA TCC-3′，測序引物為：5-ttattccttgatattttttc-3，產(chǎn)物為88bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括Taq聚合酶1U，MgCl2 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.2 μmol/L，DNA模板。PCR條件為：95℃預(yù)變性3 min，然后94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s進行30個循環(huán)后，72℃延伸8 min。取適量PCR產(chǎn)物進行單鏈化，結(jié)合測序序列后使用SNP檢測通用試劑盒PyroMarkR. Gold Q96，用焦磷酸測序儀（PyroSequencer，Qiagen）進行檢測。每一批PCR反應(yīng)均以蒸餾水替代DNA模板作為陰性對照，并隨機抽取10%的DNA標本進行二次分析以驗證分析方法的正確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù) Hardy-Weinberg平衡定律（H-W平衡定律），按以下公式計算各基因型理論頻數(shù)：CC=np2，CT=2npq，TT=nq2，其中n為樣本量，p、q分別為相應(yīng)的等位基因頻率，分別對骨肉瘤患者組及正常人群組分布進行SNP群體代表性檢驗。以χ2檢驗比較各基因型頻率在病例組與對照組之間的差異。以比值比（oddsratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidenceinterval，CI）表示各種基因型發(fā)生骨肉瘤的風(fēng)險度。OR值以非條件Logistic回歸計算，并經(jīng)性別、年齡狀況校正。統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 10.0版（SPSS Inc.， Chicago， IL）進行。

2 結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果

COL1A1基因位于17號染色體上，具體位置為17q21。rs1061970 位于UTR區(qū)域的多態(tài)性，直接影響到翻譯的效率，COL1A1擴增產(chǎn)物片段長度為88 bp，利用帶biotin的引物擴增該片段后，制備成單鏈用于焦磷酸測序，該法簡便易行，操作簡單，可實現(xiàn)高通量檢測。檢測發(fā)現(xiàn)患者組合對照組基因型頻率和等位基因頻率分布符合H-W平衡定律，并且兩者頻率分布之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04）。從而提示，COL1A1基因rs1061970位點多態(tài)性與骨肉瘤的發(fā)生有明顯相關(guān)。表1中骨肉瘤患者與正常對照組COL1A1 rs1061970位點基因型分布和基因頻率比較經(jīng)過H-W平衡檢驗在基因型頻率出現(xiàn)上無顯著差異。正常人群和骨肉瘤患者COL1A1基因多態(tài)性見表1。經(jīng)檢驗兩者在基因型頻率和等位基因頻率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由此可見，COL1A1 rs1061970基因多態(tài)性與骨肉瘤的發(fā)生有相關(guān)性。根據(jù)位點T所占人數(shù)/總?cè)藬?shù)（位點T人數(shù)+位點C人數(shù)），基因位點T在骨肉瘤患者中的比例（37.0%）要高于正常對照（27.0%），疾病風(fēng)險比為1.59，95%CI為0.99～2.57，盡管兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.056），但是攜帶T型的患者發(fā)生骨肉瘤的風(fēng)險增加。

表1 骨肉瘤患者和正常對照組基因分布以及關(guān)聯(lián)分析

注：T/T、C/T和C/C分別為COL1A1基因rs1061970位點TT型、CT型和C型；基因位點T的計算為T/T人數(shù)×2+C/T人數(shù)，基因位點C的計算為C/C人數(shù)×2+C/T人數(shù)

2.2 骨肉瘤患者 COL1A1基因多態(tài)性在各臨床亞組中的分布差異

隨后我們針對骨肉瘤患者不同基因型與臨床不同因素進行分層分析，結(jié)果顯示rs1061970位點與年齡、性別、病理類型、疾病的發(fā)生部位以及GTM分期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而與患者有無轉(zhuǎn)移存在顯著差異，rs1061970位點三種基因型頻率分布與無轉(zhuǎn)移組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明rs1061970基因型分布在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移組中存在差異；進一步對有轉(zhuǎn)移組C、T等位基因頻率分布與無轉(zhuǎn)移組進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（OR=2.111，95%CI：0.853～5.225，P=0.102），但是攜帶T的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加。見表2。

表2 骨肉瘤患者COL1A1基因rs1061970位點基因型分布與發(fā)病風(fēng)險的分層分析（n）

3 討論

骨肉瘤是異質(zhì)性比較強的疾病，其預(yù)后往往受到多種因素的影響，目前專門針對骨肉瘤預(yù)后的生物標志物主要有APE1、VEGF、mTOR、EGFR、PARP1、OGG1、BRCA1、ERCC1、XRCC1等，但是由于潛在標志物特異性不強，且多為基因表達分析，有一定波動性，因此，在一定意義上限制了臨床上應(yīng)用，亟待探索其他相關(guān)標志物，用于骨肉瘤的預(yù)后判斷。COL1A1基因也就是編碼Ⅰ型膠原α1亞單位的基因，不少研究提示該基因某些非編碼區(qū)域位點多態(tài)性可能和多種疾病有關(guān)，比如研究顯示和轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合的位點多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女腕關(guān)節(jié)骨折有關(guān)[13]，從一定意義上證實這個基因SNP和骨代謝的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1的多態(tài)性與骨肉瘤的易感性密切相關(guān)[14]，本研究從另一個角度揭示位點T與骨肉瘤的發(fā)生風(fēng)險和轉(zhuǎn)移風(fēng)險存在一定的相關(guān)性。COL1A1基因rs1061970位點基因多態(tài)性是由胸腺嘧啶核苷酸（T）替代咆嘧啶核苷酸（C）而形成，該區(qū)域處于3-UTR位置，多態(tài)性存在可能影響翻譯的效率。本研究顯示，COL1A1基因3UTR區(qū)域T→C的多態(tài)性在骨肉瘤患者以及正常對照中的基因頻率存在差異，進一步通過C和T分布頻率分析顯示，證實了 COL1A1 rs1061970位點的TC和TT，可能是風(fēng)險性因素，存在這2個位點的患者骨肉瘤的易感性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加。而CC和CT，可能是保護性因素，但是兩組差異僅在SNP分布頻率上具有統(tǒng)計學(xué)意義，而C和T之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義。該基因多態(tài)性可能調(diào)控著COL1A1基因的翻譯。我們也將臨床因素和該位點多態(tài)性進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性主要與轉(zhuǎn)移有關(guān)，而和患者的病理類型、發(fā)生部位、年齡、GTM分期和性別都沒有顯著相關(guān)性，進一步說明TC和TT可能是骨肉瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素，后續(xù)對于該位點與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的功能的深入分析，將為我們闡明COL1A1對骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)功能的影響。此外，有研究顯示，在骨肉瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)，存在COL1A1 mRNA高表達的患者[15]，最后都發(fā)生了轉(zhuǎn)移，在一定程度上提示，COL1A1的表達和患者預(yù)后存在負相關(guān)。然而，在肝癌中的研究中表現(xiàn)為COL1A1低表達的患者預(yù)后較差，并被認為是一個潛在的存活因子[16]。以上結(jié)果在一定程度上提示，COL1A1在不同腫瘤中對腫瘤預(yù)后的影響存在差異。因此，進一步研究將通過點突變的形式明確該位點變化對COL1A1表達的變化，以及通過大樣本人群的檢測探討COL1A1表達以及SNP變化和患者預(yù)后的相關(guān)性，并探討可能在上面結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子位點，以期最后明確該基因位點多態(tài)性和骨肉瘤生物學(xué)功能的關(guān)系。

另外，本研究首次利用焦磷酸測序儀檢測COL1A1基因多態(tài)性和骨肉瘤相關(guān)性。焦磷酸測序可以用于SNP，甲基化以及未知序列的檢測，盡管讀長只有5～60 bp，但是操作簡單，成本相對普通的一代和二代測序比較有優(yōu)勢，現(xiàn)在已經(jīng)有不少商品化的基于焦磷酸測序平臺的試劑盒已經(jīng)開發(fā)出來，比如EGFR、Kras的檢測試劑盒[17]，用于非小細胞肺癌替尼類藥物的伴隨診斷。因此針對若干已知位點的快速檢測可以考慮焦磷酸測序平臺，不僅可實現(xiàn)高通量而且單個樣本的檢測成本較有優(yōu)勢。

在本研究中，也存在許多不足之處，由于骨肉瘤的發(fā)病率較低，本實驗中患者的樣本收集較少，研究的患者均來自同一所醫(yī)院，使得研究樣本有較大的局限性，實驗只有1個位點，應(yīng)該在不同地區(qū)和種族中進行大樣本數(shù)據(jù)分析，并聯(lián)合多個SNP位點進行多中心研究，以最終明確COL1A1基因多態(tài)性與骨肉瘤的敏感性。

[參考文獻]

[1] Cheng Y，Ramos D，Lee P，et al. Collagen functionalized bioactive nanofiber matrices for osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells： Bone tissue engineering[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology，2013，（2）：287-298.

[2] Teixeira S，H. Fernandes M，P. Ferraz M，et al. Proliferation and mineralization of bone marrow cells cultured on macroporous hydroxyapatite scaffolds functionalized with collagen type I for bone tissue regeneration[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2010，（1）：1-8.

[3] Kuo Y C，Yeh C F. Effect of surface-modified collagen on the adhesion，biocompatibility and differentiation of bone marrow stromal cells in poly（lactide-co-glycolide）/chitosan scaffolds[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2011，82（2）：624-631.

[4] Liu L，Qin C，Butler W T，et al. Controlling the orientation of bone osteopontin via its specific binding with collagen I to modulate osteoblast adhesion[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2007，80（1）：102-110.

[5] Olsen B R. Morphogenesis：Collagen it takes and bone it makes[J]. Current Biology，1996， 6（6）：645-647.

[6] Tamiya M，Tokunaga S，Okada H，et al. Prospective study of urinary and serum cross-linked N-telopeptide of type I collagen（NTx） for diagnosis of bone metastasis in patients with lung cancer[J]. Clinical Lung Cancer，2013，14（4）：364-369.

[7] Tamiya M，Suzuki H，Kobayashi M，et al. Usefulness of the serum cross-linked N-telopeptide of type I collagen as a marker of bone metastasis from lung cancer[J]. Medical Oncology，2012，29（1）：215-218.

[8] Zhao H，Han K L，Wang Z Y，et al. Value of C-telopeptide-cross-linked Type I collagen， osteocalcin，bone-specific alkaline phosphatase and procollagen Type I N-terminal propeptide in the diagnosis and prognosis of bone metastasis in patients with malignant tumors[J]. Medical Science Monitor，2011，17（11）：CR626-CR633.

[9] 張惠忠，丘距世. 人骨肉瘤組織中Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型膠原基因的表達[J]. 腫瘤，2002，22（6）： 463-465.

[10] Inamori Y，Ota M，Inoko H，et al. The COL1A1 gene and high myopia susceptibility in Japanese[J]. Human Genetics，2007，122（2）：151-157.

[11] Zhao Y P，Wang H，F(xiàn)ang M，et al. Study of the association between polymorphisms of the COL1A1 gene and HBV-related liver cirrhosis in Chinese patients[J]. Digestive Diseases and Sciences，2009，54（2）：369-376.

[12] Kostik M M，Smirnov A M，Demin G S，et al. Genetic polymorphisms of collagen type I α1 chain（COL1A1） gene increase the frequency of low bone mineral density in the subgroup of children with juvenile idiopathic arthritis[J]. The EPMA Journal，2013，4（1）：1-8.

[13] Tilkeridis C，Bei T，Garantziotis S，et al. Association of a COL1A1 polymorphism with lumbar disc disease in young military recruits[J]. Journal of Medical Genetics，2005，42（7）：44.

[14] He M，Wang Z，Zhao J，et al. COL1A1 polymorphism is associated with risks of osteosarcoma susceptibility and death[J]. Tumor Biology，2014，35（2）：1297-1305.

[15] Wong I H N，Chan A T，Johnson P J. Quantitative analysis of circulating tumor cells in peripheral blood of osteosarcoma patients using osteoblast-specific messenger RNA markers：A pilot study[J]. Clinical Cancer Research，2000，6（6）：2183-2188.

[16] Hayashi M， Nomoto S， Hishida M， et al. Identification of the collagen type 1 alpha 1 gene （COL1A1）as a candidate survival-related factor associated with hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer，2014，14（1）：108-110.

[17] 王樹新，徐林富，王良明，等. 焦磷酸測序和雙脫氧測序法檢測結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變的對比研究[J].腫瘤學(xué)雜志，2012，18（5）：339-341.

（收稿日期：2014-09-15）