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    硫酸軟骨素對LLO誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO、ET-1的影響

    2015-03-11 02:36:19陳希穆祥許劍琴
    中國獸藥雜志 2015年11期
    關鍵詞:軟骨素分泌量微血管

    陳希,穆祥,許劍琴

    (1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2.北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京102206;3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100094)

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    硫酸軟骨素對LLO誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO、ET-1的影響

    陳希1,穆祥2*,許劍琴3*

    (1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2.北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京102206;3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100094)

    為研究李斯特菌溶血素(LLO)對大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(RIMVECs)分泌NO、內皮素(ET-1)的影響,以及硫酸軟骨素(CS)通過調節(jié)細胞微環(huán)境保護RIMVECs的作用,將體外培養(yǎng)的RIMVECs分為LLO+CS組、LLO組、CS組、空白組,經(jīng)過MTT比色法測定細胞生長情況,硝酸還原酶法測定細胞上清液細胞因子NO含量以及酶聯(lián)免疫法檢測ET-1含量,并用原位雜交方法對結果進行驗證。結果表明:LLO可抑制RIMVECs增殖活性,提高NO、ET-1分泌量且高于正常水平,并導致NO/ET-1比值失衡(下降);而CS可提高RIMVECs細胞的增殖活性,并顯著上調NO/ET-1比值。由此可知,CS可通過改善LLO引起細胞因子NO和ET-1失衡而起到保護微血管內皮細胞的作用。

    硫酸軟骨素;腸黏膜微血管內皮細胞;NO;ET-1;LLO

    產(chǎn)單核細胞李斯特菌(L.monocytogenes,LM)的致病機理是通過分泌致病因子溶血素(Listeriolysin O,LLO)作用于內皮細胞,導致細胞因子分泌紊亂,從而誘發(fā)機體產(chǎn)生病理癥狀[1]。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是由動物軟骨分離得到的一種硫酸多糖,是細胞外基質的主要成分,也是動物類中藥(骨類、角類)的重要成分之一,具有降血脂、抗凝、抗血栓形成,并有保護血管內皮免受多種化學物質損傷的作用[2]。近年來,CS作為硫酸多糖之一,具有抗凝血、調節(jié)細胞黏附、調節(jié)炎癥、調節(jié)免疫、阻礙血管生成、抗氧化等多種藥理活性[3-5]。其對體外人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用亦有報道[6]。針對文獻所報道的CS具有保護內皮細胞、調節(jié)細胞因子的作用,本研究首次以大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(Rat Intestinal Mucosal Microvascular Endothelial Cells, RIMVECs)為試驗對象,研究CS調節(jié)LLO導致的細胞微環(huán)境紊亂,以及對LLO致RIMVECs損傷的作用效果。

    1 材料和方法

    1.1 試劑及藥品材料 硫酸軟骨素標準品,HPLC≥98%, 批號A0318,成都曼思特生物科技有限公司;LLO,ProSpec-TanyTechnoGene公司;DMEM 培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清,Gibco公司;NO測試試劑盒,晶美生物工程有限公司;內皮素(ET-1)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,RB,北京尚柏生物公司;原位雜交檢測試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司,產(chǎn)品編號分別為MK1059、MK1190。

    1.2 儀器與設備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-17AC型,日本三洋公司);倒置數(shù)碼熒光顯微鏡(DMB5型,廈門麥克奧迪公司);細胞培養(yǎng)板(6、12、48孔,costar公司);細胞計數(shù)板(浙江玉環(huán)求精醫(yī)用儀器廠)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分離培養(yǎng) 選擇出生24 h之內SD大鼠,用無菌方法取出空腸,Hank’s液沖洗,縱向切開。沖洗后將組織剪成小段,吹打數(shù)次,經(jīng)胰酶消化暴露出微血管網(wǎng),接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。加入DMEM完全培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),3 d換液1次,細胞達到80%融合生長時即行傳代。倒置顯微鏡下,細胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列,無重疊生長現(xiàn)象;免疫熒光法檢測內皮細胞vWF因子相關抗原陽性。

    1.3.2 細胞準備及處理 用0.25%胰蛋白酶消化已經(jīng)融合生長的第2代RIMVECs,細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板,細胞密度5×108/L。每孔加150 μL DMEM完全培養(yǎng)基,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待融合成單層細胞后,將RIMVECs分為LLO+CS組(培養(yǎng)基中LLO濃度為50 ng/mL+CS濃度為10 μg/mL)、LLO組(LLO濃度為50 ng/mL)、CS組(CS濃度為10 μg/mL)、空白組(LLO濃度為0 ng/mL),每組設重復孔5孔,空白對照組加維持培養(yǎng)液,分別于培養(yǎng)3、6、9、12 h后收集細胞培養(yǎng)液,3000 r/min離心5 min后,取上清液于-20 ℃條件待測。

    1.3.3 細胞增殖活性的測定(MTT法) 根據(jù)文獻方法[7],將96孔細胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。吸凈細胞上清液后,在各孔細胞中加入5 mg/mL的MTT 30 mL及150 mL的DMEM維持培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕吸棄孔內液體,每孔加入150 μL DMSO,37 ℃孵育30 min 以上,使細胞內結晶充分溶解,于酶標儀570 nm波長處測定各組OD值。

    1.3.4 細胞上清液中NO、ET-1濃度的測定 根據(jù)文獻方法[8],NO濃度的測定采用硝酸還原酶法。參照試劑盒說明,以總硝酸鹽(NOx)含量表示NO 濃度。ET-1濃度的測定按照ELISA試劑盒的操作步驟進行。

    1.3.5 原位雜交 根據(jù)文獻方法[8],針對大鼠誘生型一氧化氮合酶(iNOS)靶基因的mRNA 序列為:5’-GGAAAAGGACATTAACAACAACGTGGAGAA-3’;5’-GACCAGAGGACCCAGAGACAAGCCCACCCC-3’;5’-CTTCCAGCTCAAGAGCCAGAAACGTTATCA-3’。

    針對大鼠ET-1 靶基因的mRNA 序列為:5’-GTGACTTTCCAAGGAGCTCCAGAAACAGCTGTCTT-3’;5’-AAGACAAGAAGTGCTGGAATTTCTGCCAAGCAGGA-3’

    采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術,并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法。將處理后12 h各組細胞滴加含有1/1000 DEPC的4%多聚甲醛固定,3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶,3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化,加地高辛標記的寡核苷酸探針雜交,封閉,滴加兔抗地高辛,滴加生物素化羊抗兔IgG, 3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB) 顯色,陽性結果呈棕黃色。

    2 結果與分析

    2.1 CS抗LLO對RIMVECs增殖的影響 由圖1可知,LLO組與其他各組相比,細胞增殖(OD值)極顯著下降(P<0.01)。試驗結果表明,LLO對細胞起負增殖作用,即抑制細胞增殖或對細胞造成損傷,而CS有效緩解了細胞損傷。

    2.2 CS對LLO誘導RIMVECs分泌NO、ET-1的影響 由表1可知,12 h內LLO組NO分泌量高于正常水平,而LLO+CS組NO分泌量高于LLO組,12 h內差異極顯著(P<0.01);與空白組對比,CS組RIMVECs的NO的分泌量于6-9 h有所上調,12 h時測得NO值和空白組無顯著差異(P>0.05),說明CS短期內具有上調RIMVECs分泌NO的作用。由表2可知,LLO組細胞ET-1分泌量高于空白組(P<0.01);與LLO組相比,LLO+CS組分泌量于6h開始明顯下降(P<0.05),說明CS對LLO誘導RIMVECs分泌ET-1的升高有顯著抑制作用。

    *表示與空白組對照, **代表P<0.01,*代表P<0.05;# 表示與LLO組對照, ## 代表P<0.01圖1 CS抗LLO對RIMVECs增值的影響(12 h)

    表1 各時間段細胞上清NO濃度的測定結果 mol/L

    *表示與空白組對照, ** 代表P<0.01,*代表P<0.05; # 表示與LLO組對照,## 代表P<0.01,# 代表P<0.05

    表2 各時間段細胞上清ET-1濃度的測定結果 pg/mL

    *表示與空白組對照, ** 代表P<0.01,*代表P<0.05; # 表示與LLO組對照,## 代表P<0.01,# 代表P<0.05

    2.3 CS對LLO導致RIMVECs分泌NO、ET-1平衡紊亂的影響 生理狀態(tài)下NO、ET-1是一對維持動態(tài)平衡的細胞因子,根據(jù)前面測定的各組細胞NO、ET-1分泌量,計算出NO/ET-1的比值,觀察CS對維持細胞微環(huán)境穩(wěn)定的影響。如圖2所示,空白組比值維持在10左右,而CS有效緩解了LLO導致的NO/ET-1失衡。

    圖2 不同時間段測得各組細胞NO/ET-1的比值

    2.4 陽性細胞胞漿平均光密度值 由表3和圖3可知,處理后12 h,測定各組細胞平均光密度值與NO、ET-1 mRNA表達量測定值一致。

    表3 NO、ET-1 mRNA表達陽性細胞胞漿平均光密度值(12 h)

    A:空白組iNOS表達;B:LLO組iNOS表達;C:LLO+CS組iNOS表達;D:空白組ET-1 mRNA表達;E:LLO組ET-1 mRNA表達;F:LLO+CS組ET-1 mRNA表達圖3 各組iNOS、ET-1 mRNA表達結果(12 h)

    3 討論與小結

    血管內皮細胞受損是創(chuàng)傷、感染、休克、腫瘤、全身性炎癥反應綜合征以及多器官功能障礙發(fā)生、發(fā)展的病理學基礎[9-11]。腸黏膜作為機體屏障部位,必然在腸道感染、細菌移位中起到關鍵作用。而腸黏膜上的微血管內皮細胞不僅是被動的靶細胞,更是一種效應細胞,可分泌NO對動、靜脈和微血管均有擴張作用,能夠抑制缺氧引起的血管收縮,并具有抗血栓形成的作用;而ET-1是目前已知的最強大的血管收縮劑,其作用正好同NO相頡頏,兩者之間的動態(tài)平衡是調控血管壁緊張度,微血管內微血栓形成的重要因素。試驗結果表明,CS可有效上調LLO誘導的NO分泌,同時下調RIMVECs分泌的ET-1,其實質是調節(jié)NO/ET-1的比值。藥物通過調節(jié)一對互相頡頏的活性物質,使其從紊亂狀態(tài)形成新的平衡,維持機體細胞微環(huán)境穩(wěn)定,有效控制疾病的發(fā)生發(fā)展。

    NO的合成需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的參與。NOS主要有誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和原生型一氧化氮合酶(cNOS)。本試驗原位雜交中檢測的iNOS在正常條件下不存在或少量表達,毒素或其他細胞因子刺激時誘導其基因表達,經(jīng)數(shù)小時即可產(chǎn)生大量的NO。而cNOS在正常條件下即存在,是細胞結構的一部分,調控生理狀態(tài)下NO的基礎釋放,其主要的生物效應為傳遞細胞間的信息。因此,原位雜交試驗以iNOS作為檢測標準。試驗中測定各組細胞平均光密度值與NO、ET-1 mRNA表達量測定值一致,該比對結果證實了CS具有調控LLO誘導的RIMVECs分泌NO、ET-1的作用。

    研究結果表明,RIMVECs是LLO作用的主要靶細胞,且CS可通過保護RIMVECs的增殖、調控LLO誘導的RIMVECs分泌NO、ET-1及mRNA表達。CS具有緩解LLO導致RIMVECs損傷的功效,將為后續(xù)的抗菌中藥成分方劑研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

    [1] Kayal S, Lilienbaum A, Poyart C,etal.Listeriolysin O-dependent activation of endothelial cells during infection with Listeria monocytogenes: activation of NF-kB and upregulation of adhesion molecules and chemokines[J].Molecular Microbiology, 1999, 31(6): 1709-1722.

    [2] 張愛娟, 周序斌, 張黎華,等.甘糖酯對實驗性動脈內皮保護作用的研究[J].中國藥理學通報, 1995,11: 323.

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    (編輯:李文平)

    Effects of Chondroitin Sulfate on the Secretion of NO and ET-1 in Rat Intestinal Mucosa Microvascular Endothelial Cells Induced by LLO

    CHEN Xi1,MU Xiang2*, XU Jian-qin3*

    (1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

    The purpose of this study was to investigate the treatment mechanism of the chondroitin sulfate (CS) on the listeriosis and the secretion of NO and ET-1 in rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMVECs) induced by listeriolysin O (LLO).RIMVECs in culture were divided into LLO+CS, LLO, CS and blank control groups.Cells were assessed proliferation by MTT assay.The Changes of NO and ET-1 level were measured by the method of nitratase, ELISA and hybridizationinsitu.Compared with other groups, proliferation of LLO group was very significantly decreased.The production of NO and ET-1 were enhanced for 12 h, and NO/ET-1 ratio was lower.CS could regulate imbalance of NO/ET-1 induced by LLO and improve the local microcirculation of intestine.

    chondroitin sulfate;intestinal mucosa microvascular endothelial cells;NO;ET-1;LLO

    北京市自然科學基金A類重點項目(6061001);北京市教委人才強教“學術創(chuàng)新團隊”中藥方劑研究(5090245)

    陳希,博士,從事中獸藥相關方面研究。

    穆祥,E-mail: muxiang1109@sina.com;許劍琴,E-mail:jianqinxucau@126.com

    2015-10-28

    A

    1002-1280 (2015) 11-0025-05

    S853.74

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