一種新型家蠅幼蟲抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表達及抑菌活性檢測

李文婷，閆恕，張丹丹，賈博巖，唐艷，孔令聰，

裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

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一種新型家蠅幼蟲抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表達及抑菌活性檢測

李文婷1，閆恕1，張丹丹1，賈博巖1，唐艷1，孔令聰1，

裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學,動物科學技術學院，長春 130118；2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林農(nóng)業(yè)大學，長春 130118)

利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達新型家蠅抗菌肽MDAP-2基因(Muscadomesticaantimicrobial peptide,MDAP-2)，為其作為新型抗菌物質(zhì)應用于臨床提供實驗依據(jù)。根據(jù)已有的MDAP-2的氨基酸序列，采用PCR技術擴增獲得MDAP-2基因，構建真核重組表達質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2，將線性化的重組質(zhì)粒電擊轉入畢赤酵母(P.pastoris)感受態(tài)GS115細胞內(nèi)，將PCR鑒定為陽性的重組酵母菌進行甲醇誘導表達，并采用Tricine-SDS-PGAE檢測表達產(chǎn)物的大小，經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得純度較高的重組蛋白，采用管碟法檢測重組蛋白的生物學活性。結果顯示，重組質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2獲得高效表達，蛋白分子量為7.8 kD，管碟法檢測重組蛋白對大腸桿菌與沙門氏菌均具有體外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表達為進一步研究表達產(chǎn)物的生物學及免疫學活性奠定基礎。

家蠅抗菌肽(MDAP-2)；畢赤酵母；分泌表達；抑菌活性

家蠅(Muscadomestica)常生活在多種病原菌孳生的環(huán)境中而自身很少染病，這緣于其體內(nèi)外抗菌活性物質(zhì)作用的結果[1]，抗菌肽作為家蠅體內(nèi)強效的抗菌活性物質(zhì)之一，其可抑殺多種致病菌、病毒、原蟲，且對正常生物體細胞無破壞作用[2]。因此，本課題組成功克隆得到新型家蠅抗菌肽MDAP-2的核苷酸序列，其開放閱讀框(ORF)198 bp，Genbank登錄號(KJ787648)，與Genbank上其它抗菌肽基因均不具有同源性，其原核表達產(chǎn)物對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌均有體外抑菌活性[3]。由于原核表達系統(tǒng)缺少蛋白翻譯后修飾和加工，如空間結構的正確折疊，糖基化等特點，很難表達出具有天然活性的抗菌肽，如果用其作為抗菌物質(zhì)應用于臨床，后期處理工序較為復雜，導致生產(chǎn)成本大幅度增高[4]，使得抗菌肽的臨床應用受到一定限制。而畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于酵母菌是真核生物，與動物細胞一樣具有轉錄、翻譯后加工修飾的功能，表達出的抗菌肽具有天然活性，并且抗菌肽對酵母的殺傷力較弱，發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽不必進行復雜的分離純化[5]，因此，本研究采用PCR技術擴增MDAP-2全長序列對其進行真核表達，并對表達產(chǎn)物進行生物學活性分析，為開發(fā)出新一代高效、無毒、不耐藥可應用于臨床的抗菌藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 文庫及菌株、表達載體 致病性沙門氏菌誘導家蠅幼蟲cDNA文庫，3’RACE-Ready cDNA由吉林農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理實驗室完成[6]；實驗菌株E.ColiDH5α、P.pastoris受體菌GS115、表達載體pPIC9K均由吉林農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理實驗室保存；克隆載體pMD18-T，大連Takara有限公司。

1.1.2 主要試劑 ExTaqTMDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ、DL 2000TMDNA Marker、λ-HindⅢ digest DNA Marker等，大連TaKaRa有限公司；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、超低分子量蛋白Maker，北京索萊寶生物公司；抗生素G418，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.2MDAP-2全長基因擴增及克隆 以3’RACE-Ready cDNA為模板，P1、P2為引物進行PCR反應。反應體系(25 μL)：模板1 μL，P10.5 μL，P20.5 μL，dNTP1 μL，Taq 酶0.3 μL，10×緩沖液2.5 μL，去離子水19.7 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃總延伸10 min，循環(huán)次數(shù)為32次。

PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T克隆載體連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切驗證為陽性，送生物公司測序并進行序列分析。該重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-MDAP-2。

1.2.3 重組表達載體pPIC9K-MDAP-2的構建用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pMD18-T-MDAP-2重組質(zhì)粒和pPIC9k表達載體，膠回收MDAP-2基因片段和pPIC9k載體片段，連接并轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行雙酶切(EcoRⅠ和NotⅠ)鑒定，將獲得的陽性質(zhì)粒送生物公司測序并進行序列分析。將重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-MDAP-2。

1.2.4 pPIC9K-MDAP-2質(zhì)粒轉化畢赤酵母 將10 μL經(jīng)SacI限制性內(nèi)切酶線性化后的pPIC9K-MDAP-2的質(zhì)粒，用電穿孔法(1500 V、25 μF、200 Ω、4 ms)轉入P.Pastoris(GS115)細胞并涂布在YPD平板上，pPIC9K 質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，其轉染的宿主菌能抗氨基糖甙類抗生素(G418)。本研究采用含不同濃度G418的YPD平板來篩選高拷貝轉化子，30℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。

1.2.5 重組酵母的PCR鑒定 將篩選后的高拷貝轉化子挑取單菌落活化至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，提取P.pastoris重組菌基因組，PCR鑒定陽性重組酵母菌。PCR條件如下：95 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃總延伸10 min，循環(huán)次數(shù)為32次。

1.2.6MDAP-2基因的誘導表達、表達產(chǎn)物 Tricine-Tris-SDS-PAGE分析劃線接種陽性重組酵母菌于含125 μg/mL的G418的YPD平板上，30 ℃溫箱培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃搖床(250 r/min)培養(yǎng) 24 h，離心，去上清，轉接部分菌體至50 mL BMMY培養(yǎng)基中，使OD值達到1，隨即加入500 μL 5%甲醇進行誘導表達,每隔24 h補加500 μL 5%甲醇,120 h后誘導表達結束。同時以pPIC9K空載體質(zhì)粒轉入P.pastoris(GS115)細胞的陽性重組菌在相同條件下誘導表達作為陰性對照。于24、48、72、96 h分別取1 mL菌液樣品，分離樣品，上清液經(jīng)TCA濃縮[7]后加入滅菌水20 μL及20 μL的2×Tricine蛋白上樣緩沖液，沸水裂解10 min，用Tricine-Tris-SDS-PAGE測定表達產(chǎn)物的相對分子量。

1.2.7 重組蛋白的純化及其的活性鑒定 通過鎳柱純化后的蛋白進行Tricine-Tris-SDS-PAGE檢測純化產(chǎn)物，并用管碟法[8]鑒定純化產(chǎn)物的抑菌活性。取100 μL菌液(105CFU/mL)均勻涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯內(nèi)加入50 μL純化后的蛋白，37 ℃培養(yǎng)12 h左右，觀察有無抑菌環(huán)出現(xiàn)，并檢測抑菌環(huán)大小。

2 結果2.1 MDAP-2全長基因的擴增及克隆 MDAP-2基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到大小為216 bp的目的條帶(圖1) 。通過雙酶切鑒定以及序列測序結果表明，PCR產(chǎn)物即為 MDAP-2基因的全長(圖2)。

M：DL2000 DNAMaker；1：MDAP-2全長基因擴增片段圖1 MDAP-2全長基因的擴增結果

M：DL2000 DNAMaker；1：pMD-18T-MDAP-2重組質(zhì)粒雙酶切圖2 pMD-18T-MDAP-2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(EcoRⅠ，NotⅠ)

2.2 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2的構建和其線性化結果 通過雙酶切(圖3) 鑒定時出現(xiàn)大小為216 bp左右的一條清晰條帶，與目的基因的大小基本相符，序列測定結果正確表明重組表達質(zhì)粒pPIC9k-MDAP-2構建成功。pPIC9k-MDAP-2線性化結果可見大小在9300 bp左右有單一的清晰條帶，表明線性化成功(圖4)。

M1：λ-HindⅢ Marker；M2：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒雙酶切(EcoRⅠ，NotⅠ)圖3 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 PCR鑒定重組酵母菌 通過G418篩選出高拷貝的轉化子，提取pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌基因組，以其為模板，以P1和P2為引物進行PCR 擴增，擴增出正確條帶(216 bp) (圖5) ，說明pPIC9k-MDAP-2穩(wěn)定整合到P.pastoris(GS115)的染色體中。

M：λ-HindⅢ Marker；1：pPIC9k-MDAP-2線性化產(chǎn)物圖4 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒線性化結果

M：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌圖5 GS115-pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌PCR鑒定結果

2.4 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物的分子量約為7.8 kD，理論上，分子量低于15 kD的多肽在常規(guī)Tris甘氨酸電泳系統(tǒng)中難以得到理想的電泳分辨率。因此使用Tricine(三羥甲基氨基甘氨酸) 代替甘氨酸作為終止離子，使其得到較好的分辨率。在72 h時經(jīng)甲醇誘導蛋白可見表達，在96 h時蛋白表達條帶較為明顯(圖6)。以96 h經(jīng)甲醇誘導的pPIC9K空載體重組酵母菌作為對照。

M：超低分子量蛋白Maker；1：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物(72h)；2：pPIC9K空載體誘導表達產(chǎn)物；3：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物(96h)圖6 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

2.5MDAP-2重組蛋白的純化 純化后的蛋白進行Tricine-Tris-SDS-PAGE檢測，得到一條單一的分子量為7.8 kD的蛋白條帶(圖7)。

M：超低分子量蛋白Maker；1：純化后的MDAP-2重組蛋白圖7 純化后MDAP-2重組蛋白Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

1：MDAP-2純化后重組蛋白；N：洗脫液圖8 純化后MDAP-2重組蛋白對大腸桿菌

1：MDAP-2純化后重組蛋白；N：洗脫液圖9 純化后MDAP-2重組蛋白對沙門氏菌抑菌活性檢測

2.6MDAP-2重組蛋白的抑菌活性檢測 采用管碟法對純化后的MDAP-2重組蛋白進行抑菌活性檢測，結果顯示MDAP-2重組蛋白對大腸桿菌有抑菌活性(圖8)，且對沙門氏菌具有抑菌活性(圖9)，均以純化洗脫液為對照。

3 討論

采用畢赤酵母表達系統(tǒng)對新型家蠅抗菌肽MDAP-2基因進行了表達，發(fā)酵過程中外源蛋白產(chǎn)率受到多方面影響如遺傳因素和培養(yǎng)條件，本研究采用序列優(yōu)化的方法，添加增強真核基因翻譯效率的kozak序列，并采用分批培養(yǎng)的方法，較連續(xù)培養(yǎng)相比其優(yōu)勢在于可以達到較高的細胞密度且便于控制。結果表明，經(jīng)過優(yōu)化的序列以及嚴格的控制培養(yǎng)條件使MDAP-2獲得高效表達。在對MDAP-2進行體外抑菌活性檢測時，為排除酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的干擾將上清液凍干后用無菌水溶解，結果發(fā)現(xiàn)其表達產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌均具有較高的抑菌活性，說明經(jīng)過真核表達修飾加工后具有天然N端的家蠅抗菌肽MDAP-2蛋白接近于天然蛋白的構象，具有較高的生物學活性。真核生物細胞膜表面大量的膽固醇和膜蛋白，使其趨于穩(wěn)定, 可抵御抗菌肽的殺細胞作用，這就決定了抗菌肽對正常的真核細胞的生長沒有影響[9]，因此，家蠅抗菌肽MDAP-2對酵母細胞的殺傷力較弱，其表達效率較高，發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽不必進行復雜的分離純化，可以直接作為飼料添加劑應用于臨床，具有更為廣泛的應用前景。

近年來，畢赤酵母表達系統(tǒng)得到了優(yōu)化，Wu等[10]利用AOX1和GAP啟動子組合共表達重組蛋白表達效率會比單獨使用AOX1啟動子高約兩倍；王慧等[11]利用雙質(zhì)粒共表達體系提高融合蛋白在畢赤酵母中的表達量；付玲等[12]優(yōu)化了pPIC9k表達載體，彌補了一些常用載體的不足之處，無論在克隆方式還是在對外源蛋白的分泌表達提高方面都有一定的改進。今后研究中，可根據(jù)畢赤酵母的偏嗜性優(yōu)化密碼子、應用AOX1和GAP啟動子組合共表達重組蛋白等方法來提高MDAP-2蛋白的表達量，為家蠅抗菌肽MDAP-2應用于臨床進行進一步摸索。

[1] 馬紅霞, 孫娜, 裴志花, 等.家蠅抗菌肽的研究進展[J].中國獸藥雜志, 2007, 41(11): 45-49.

[2] 鐘雅.一個新家蠅抗菌肽的分離純化和部分性質(zhì)研究[D].華中科技大學, 2007.

[3] Pei Z H, Sun X N, Tang Y,etal.Cloning, expression, and purification of a new antimicrobial peptide gene from Musca domestica larva[J].Gene, 2014, 549(1): 41-45.

[4] 胡世界, 羅素蘭, 張吉貞, 等.巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)及其高水平表達策略[J].生物技術, 2007, 17(6): 78-83.

[5] 仲飛.動物抗菌肽新型飼料添加劑的研究與開發(fā)[J].北方牧業(yè), 2009, 8: 1-2.

[6] 張惠.沙門氏菌誘導家蠅幼蟲SSH文庫構建及差異表達基因分析[D].長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學, 2011.

[7] 孫勇, 彭曦, 張勇, 等.hITF畢赤酵母表達載體的構建及分泌表達[J].第三軍醫(yī)大學學報, 2006, 28(6): 527-530.

[8] 何曉鋒, 曹晉桂, 劉芳, 等.管碟法在監(jiān)測金黃色葡萄球菌對苯扎溴銨抗性中的應用[J].中華醫(yī)院感染學雜志, 2014, 24(20): 5198-5200.

[9] 崔艷紅, 黃現(xiàn)青.抗菌肽的抗菌機理及其應用[J].中國獸醫(yī)雜志, 2006, 42(9): 51-52.

[10]Wu J M, Lin J C, Cheng L L,etal.Combined use of GAP and AOX1 promoter to enhance the expression of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in Pichia pastoris[J].Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(4): 453-459.

[11]王慧, 竇文芳, 張曉梅, 等.應用雙質(zhì)粒共表達體系提高融合蛋白GGH在畢赤酵母GS115中的表達量[J].生物工程學報, 2011, 27: 983-989.

[12]付玲.畢赤酵母表達載體pPIC9k的優(yōu)化[D].武漢: 湖北大學, 2012.

(編輯：陳希)

Eukaryotic Expression of a Novel Antimicrobial Peptide Gene (MDAP-2) fromMuscadomesticaLarvae and Its Antibacterial Activity

LI Wen-ting1, YAN Shu1, ZHANG Dan-dan1, JIA Bo-yan, TANG Yan1, KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Pichiapastorisexpression system was applied to express a novel antimicrobial peptideMDAP-2 gene fromMuscadomestica, which provide experimental evidence forMDAP-2 used as a new antimicrobial substance in clinical application.Based on the amino acid sequence of antibiotical peptideMDAP-2, which was previously identified, polymerase chain reaction (PCR) technique was performed to amplified theMDAP-2 gene, and eukaryotic recombinant expression plasmid pPIC9K-MDAP-2 was constructed, subsequently the recombinant plasmid was digested used to transformed thePichiapastoris(GS115 cells) through electroporation.The positive recombinant pPIC9k-MDAP-2 which detected by PCR induced by addition of methanol, using tricine-SDS-PAGE detected the weight of recombinantMDAP-2 protein.The recombinantMDAP-2 was purified using Ni-NTA HisTrap FF crude column chromatography and the bacteriostatic activity of the recombinant purifiedMDAP-2 protein was assessed by tube plate method.The test results showed that the molecular weight of recombinantMDAP-2 protein was about 7.8 kD,MDAP-2 had in vitro antibacterial activity againstEscherichiacoliandSalmonellapullorum.TheMDAP-2 gene was expressed successfully inPichiapastorisexpression system which provide reference for further research in the biological and immunologic activities ofMDAP-2.

MuscadomesticaMDAP-2;Pichiapastoris; secretory expression; antibacterial activity

國家自然科學基金資助項目(31140026，31572574，31502121)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Y05)

李文婷，碩士研究生，從事動物藥理和毒理學研究。

馬紅霞。E-mail：hongxia0731001@163.com

2015-07-23

A

1002-1280 (2015) 11-0011-06

S852.6