雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆與序列分析

于雷，張賀楠，張釗偉，程海波，史張燕，周建民

(1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)

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雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆與序列分析

于雷1，張賀楠1，張釗偉1，程海波2，史張燕2，周建民1

(1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)

2015年1月從安徽省某疑似患雞傳染性支氣管炎雞場(chǎng)中分離到一株雞傳染性支氣管炎病毒，命名為AH1/15株，使用特異性引物對(duì)AH1/15分離株S1基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定，并將其與國(guó)內(nèi)外流行株及參考毒株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，IBV AH1/15株S1基因全長(zhǎng)為1638 bp；同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AH1/15株與國(guó)內(nèi)外疫苗毒株核苷酸同源性為57.0%～59.6%；遺傳進(jìn)化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AH1/15株與國(guó)內(nèi)外主要疫苗株以及流行的LX4型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與近幾年國(guó)內(nèi)分離的CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/SD09/005等毒株親緣關(guān)系最近。結(jié)果表明，AH1/15是一株不同于疫苗株和流行株的變異株。

傳染性支氣管炎病毒；S1基因；序列分析

雞傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前主要采用疫苗接種的方法來(lái)預(yù)防該病，Mass型疫苗在國(guó)內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，但由于IBV基因組易突變及頻繁重組的特點(diǎn)，在傳播過(guò)程中導(dǎo)致多種基因型及血清型毒株的產(chǎn)生[2]，加之不同血清型之間交叉免疫性很低[3]，這就導(dǎo)致免疫雞群依然會(huì)受IBV野毒的威脅，給我國(guó)IB疫情防控帶來(lái)了極大的困難。由于IBV的S1蛋白在致病性、組織嗜性及宿主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合方面都有重要作用[4]，同時(shí)是中和抗體的主要誘導(dǎo)者[5]，且S1基因型劃分與血清學(xué)分型具有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系[3]，所以常用此基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系、序列分析來(lái)研究IBV的流行趨勢(shì)。AH1/15株分離自安徽某發(fā)病雞場(chǎng)，本試驗(yàn)對(duì)其S1基因進(jìn)行測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，以了解其分子流行病學(xué)特征，為該病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法1.1 毒株 IBV AH1/15株來(lái)自安徽某發(fā)病商品雞群，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院分離和保存。

1.2 菌種和載體E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α、克隆載體pEASY-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑與酶類 Ex Taq酶、DNA Marker、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Maker Trans2K Plus均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)IBVS1基因兩端外的保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增S1全基因的引物，上游引物：GTGTATTTTGACGTTGCTAAG；下游引物：AGCAAAGGTGCCACAAAATG，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1868 bp。引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。

1.5 IBVRNA的提取 按照RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書操作，從雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株的雞胚尿囊液中提取病毒RNA。

1.6 IBVAH1/15株S1基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 以提取的病毒RNA為模板，通過(guò)隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以合成的cDNA為模板，通過(guò)上、下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增S1基因，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后按以下參數(shù)(變性：94 ℃ 30 s；退火：53 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 1 min 45 s)進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。

1.7 S1基因的序列分析 應(yīng)用DNAStarLasergene 7.0軟件對(duì)AH1/15株的S1基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，利用MEGALIGN程序的Clustal W方法對(duì)分離株和參考毒株的S1基因核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比和分析。采用MEGA 4.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)方法進(jìn)行遺傳演化分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析中涉及的IBV參考毒株及其S1基因GenBank登錄號(hào)見表1。

表1 參考毒株及其GenBank登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV S1基因的擴(kuò)增 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見特異條帶，與預(yù)期片段大小相符，見圖1。

M：Trans2K Plus Marker 1：S1基因的RT-PCR產(chǎn)物 2：陰性對(duì)照?qǐng)D1 AH1/15株S1基因的RT-PCR產(chǎn)物

2.2 序列比對(duì)結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，IBV AH1/15株S1基因全長(zhǎng)為1638 bp(含裂解位點(diǎn))；選取具有代表性的國(guó)內(nèi)外毒株及疫苗株進(jìn)行S1全基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示，IBV AH1/15株S1基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)廣泛使用的Mass型疫苗株H120、H52的同源性為57.0%和57.1%，與LDT3型tl/CH/LDT3/03毒株同源性為59.6%，與4/91毒株同源性為59.2%，與QX株、LX4株的同源性分別為60.2%和60.3%，與LSC99I毒株同源性為53.5%，與LDL97I毒株同源性為57.3%，與國(guó)內(nèi)外近些年分離的CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005ck-CH-LHB-110615、K46/10和K23/10毒株同源性較高，為98.0%～99.3%，其中與CK/CH/GD/CG11同源性最高，為99.3%。以疫苗株H120、M41、4/91和LDT3為參考株，AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4和CK/CH/SD09/005S1基因表現(xiàn)為廣泛性點(diǎn)突變，多處堿基插入或缺失，且大多具有相同的插入和缺失位點(diǎn)；AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4毒株和同源性較高的CK/CH/SD09/005、ck/CH/LHB/110615、K46/10和K23/10相比在S1基因283～285 nt處也有3 堿基缺失。

2.3 以IBV S1全基因?yàn)榛A(chǔ)的遺傳進(jìn)化分析 利用MEGA4.0軟件對(duì)AH1/15株和其他參考毒株遺傳進(jìn)化分析并生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2。

圖2 AH1/15株(▲標(biāo)記)S1基因與參考毒株核酸系統(tǒng)進(jìn)化分析

分析結(jié)果表明，AH1/15株與參考毒株形成7個(gè)進(jìn)化分支(基因型)。LX4、QX、A2等毒株形成LX4型分支，4/91、7/93B屬于4/91型，LNM 05I、LGD 04II等構(gòu)成CK/CH/LSC/99I型，CH/CH/LDL/97I型包括LDL97I、LDL98I等，國(guó)內(nèi)疫苗株H120、H52、M41和LDT3則分屬于Mass型和tl/CH/LDT3/03型。分離株AH1/15株和前6 個(gè)分支遺傳距離較遠(yuǎn)，與2007年以來(lái)國(guó)內(nèi)和韓國(guó)分離株CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005、K46/10等形成獨(dú)立的進(jìn)化分支。

3 討論

近年來(lái)，通過(guò)S1基因分型的方法研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)同時(shí)流行多個(gè)IBV基因型的毒株，如LX4型、CK/CH/LSC/99I型、CK/CH/LDL/97I、tl/CH/LET3/03型、Mass型等，其中LX4型是目前流行最為廣泛的基因型，比例超過(guò)50%，部分地區(qū)甚至高達(dá)75%[3,6]。

當(dāng)前，IB仍是困擾我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，臨床發(fā)病普遍，疫苗免疫預(yù)防是控制該病的最為有效的手段之一。目前國(guó)內(nèi)使用疫苗的基因型多為Mass型，但是Mass型毒株只占國(guó)內(nèi)分離毒株的一部分，大部分分離毒株與其遺傳距離較遠(yuǎn)。Mass型的疫苗已經(jīng)不能對(duì)當(dāng)前流行的LX4型、CK/CH/LSC/99I型等毒株產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)[7]，因此，研發(fā)具有針對(duì)性的疫苗顯得尤為必要。

AH1/15株與CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11等屬于獨(dú)立的進(jìn)化分支，與LX4、4/91和Mass基因型毒株遺傳距離均較遠(yuǎn)，其S1基因不僅有較多的堿基突變，而且還有多處堿基插入和缺失。這是2007年以來(lái)新出現(xiàn)的一個(gè)基因型，TC07-2是首次報(bào)道的此類毒株[8]，山東和韓國(guó)也先后報(bào)道了這一新型IBV流行株[9-10]，提示該類毒株在亞洲地區(qū)已經(jīng)形成一定程度的流行，并且Mass型H120活疫苗不能對(duì)該基因型的毒株產(chǎn)生有效的保護(hù)[10]，這也就不難解釋本研究中的發(fā)病雞場(chǎng)即使進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的傳染性支氣管炎疫苗免疫，但是仍然感染雞傳染性支氣管炎的現(xiàn)象。

因此，我們要對(duì)IB進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，同時(shí)有必要針對(duì)性地選擇IB疫苗對(duì)分離野毒進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)或研制新型IB疫苗，為IB防控提供科學(xué)依據(jù)。

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(編輯：李文平)

Cloning and Sequence Analysis of S1Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus AH1/15 Strain

YU Lei, ZHANG He-nan, ZHANG Zhao-wei, CHENG Hai-bo2, SHI Zhang-yan2, ZHOU Jian-min

(1.ChinaAnimalHusbandryIndustryCo.,Ltd,KeyLaboratoryofBiologicalProductsandChemicalDrugsforAnimals,MinistryofAgriculture,Beijing100095,China; 2.QYHBiotechCompanyLimited,Beijing100083,China)

One infectious bronchitis virus (IBV) was isolated from Anhui province, named as AH1/15 isolate.S1 gene of the strain was amplified, cloned and sequenced.The S1gene of the strain was composed of 1638 base pairs, the nucleotide acid similarities among the vaccine strains and the AH1/15 strain were57.0%～59.6%.The genetic evolution analysis showed that AH1/15 strain had far relationship with the vaccine strains andLX4 type strains, but showed the closest relationship with the strains which isolated in recent years, such as CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11 and CK/CH/SD09/005.The result showed that the variant IBV AH1/15 was different from vaccine and epidemic strains.

infectious bronchitis virus；S1 gene；sequence analysis

于雷，碩士，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，從事獸用生物制品研發(fā)工作。E-mail：sgyulei@sohu.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0017-04

S852.65