香蕉束頂病毒(BBTV)的快速提取檢測(cè)方法

江　沄， 孫　薇， 張煜隆,2， 劉小娟,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 福建 福州 350002；

2.福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

香蕉束頂病毒(BBTV)的快速提取檢測(cè)方法

江沄1， 孫薇1， 張煜隆1,2， 劉小娟1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 福建 福州 350002；

2.福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

摘要:香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)是香蕉上一種危害嚴(yán)重但又難以防治的病毒。目前只能通過及時(shí)鏟除染病植株來控制傳播，因此快速有效的病毒檢測(cè)技術(shù)是防治BBTV的關(guān)鍵。BBTV為單鏈環(huán)狀DNA病毒，本試驗(yàn)采用優(yōu)化后的DNA提取方法提取感病的香蕉樣品的DNA，并用特異性引物對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示本試驗(yàn)優(yōu)化的方法操作方便、用時(shí)短，并且提取產(chǎn)物能夠用于BBTV快速檢測(cè)，從而為BBTV的快速檢測(cè)提供新的方法。

關(guān)鍵詞:香蕉束頂病毒； DNA提??； 快速檢測(cè)

香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)是香蕉生產(chǎn)中的一個(gè)最嚴(yán)重的病毒，由它引起的香蕉束頂病威脅著世界上25%的香蕉種植區(qū)(Dale，1987)，感染BBTV的香蕉果實(shí)小而且少，甚至不能結(jié)實(shí)，該病發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)香蕉生產(chǎn)通常無利可圖。香蕉束頂病毒是單鏈環(huán)狀DNA病毒，目前一致認(rèn)為，BBTV為18-20 nm等軸的二十面體結(jié)構(gòu)，基因組至少是由6個(gè)大小約1.0-1.1 kb的環(huán)狀ssDNA組分組成，分別命名1、2、3、4、5、6組份(Hardingetal，1991)，都由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分構(gòu)成(Xieetal，1995；Beethametal，1999；Burnsetal，1995)。

香蕉主要通過組培技術(shù)進(jìn)行無性繁殖，一旦種苗帶毒，香蕉病毒的傳播和危害就會(huì)加劇。種植區(qū)一旦有毒株應(yīng)該及時(shí)清除，否則發(fā)病植株會(huì)成為病源使病毒在整個(gè)種植區(qū)蔓延。因此，快速有效的BBTV檢測(cè)技術(shù)是防治BBTV的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)香蕉病毒的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法(范國(guó)成等，1999)、PCR法(周莉娟等，2001)及免疫PCR等，國(guó)外有利用多重免疫捕捉PCR檢測(cè)香蕉病毒病的報(bào)道。一些植物病毒的檢測(cè)用到的膠體金免疫層析試紙條法雖然操作方便、反應(yīng)靈敏，但目前還沒有研發(fā)用于檢測(cè)BBTV的試紙條。

由于香蕉葉片富含多酚、多糖等次生代謝物，因此使用普通的DNA提取方法很難將其基因組DNA分離純化。目前提取富含多酚多糖的香蕉DNA的方法有基于SDS基礎(chǔ)上的改良方法(柴娟等，2014)；SDS、CTAB和PVP法(杜道林等，2003)；Paterson等人在1993年提出的以多酚物質(zhì)棉花為材料的DNA提取方法等。

為了提高檢測(cè)香蕉束頂病的效率，本試驗(yàn)通過優(yōu)化DNA的提取方法，建立了一種快速且操作方便的香蕉束頂病的檢測(cè)方法，為生產(chǎn)實(shí)踐提供有力的技術(shù)保障。

1 試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)試劑

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室人員研發(fā)的專利申報(bào)號(hào)為：201410492569的快速無毒DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)后開發(fā)的北京德曼特爾生物科技有限公司快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒、10×Loading bufer購自寶生物工程(大連)有限公司、2×Es Taq Master Mix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2試驗(yàn)儀器

5417R 臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)、T3000 PCR 熱循環(huán)儀(Biometra)、DYY-6C 電泳儀、GeneGenius 凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf) 、DK-8D 電熱恒溫水槽等。

1.3樣品

香蕉病株及香蕉鍵株。

2試驗(yàn)方法

2.1模板DNA的提取

本試驗(yàn)中DNA的提取皆使用購自北京德曼特爾生物科技有限公司快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒，并根據(jù)香蕉樣品的特性，對(duì)提取過程進(jìn)行優(yōu)化。

具體操作步驟如下：

(1)將洗脫緩沖液EB和緩沖液PL1在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱。

(2)將200 μL柱處理液CL加入DNA吸附柱SC，10 000 rpm室溫離心1 min，棄廢液。

(3)取一定重量的樣品剪碎后放入2mL離心管，并加入滅過菌的4 mm小鋼珠2粒。將樣品用液氮速凍后放入鋁盒中上下晃動(dòng)10 s。重復(fù)4-6次至植物組織成粉末狀。(注：若樣品打成粉末狀后沒有馬上加緩沖液PL1，則需將樣品放置于4 ℃冰箱中保存，以免影響提取效果。)

(4)加入100 μL 65 ℃預(yù)熱的緩沖液PL1，室溫放置2-3 min，期間不斷上下顛倒混勻數(shù)次，保證緩沖液PL1充分浸潤(rùn)樣品。

(5)加入600 μL緩沖液PL2，室溫放置2-3 min，期間不斷上下顛倒混勻數(shù)次。

(6)用磁鐵吸出離心管內(nèi)的鋼珠，10 000 rpm室溫離心1 min。

(7)轉(zhuǎn)移上清液到步驟2處理過的DNA吸附柱SC中，10 000 rpm室溫離心1 min，棄廢液。

(8) 往DNA吸附柱SC中加入300 μL緩沖液PL2 ，10 000 rpm室溫離心1 min，棄廢液。

(9) 往DNA吸附柱SC中加入650 μL漂洗液WB ，10 000 rpm室溫離心1 min，棄廢液。

(10)10 000 rpm室溫離心1 min。

(11)把DNA吸附柱SC轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，開蓋，室溫放置2 min，加入30 μL預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，靜置2 min。

(12) 洗脫DNA，12 000 rpm室溫離心1 min。

2.2PCR檢測(cè)

用2.1中方法提取出的帶病香蕉總DNA為模板，采用譚小勇等(2010)的 BBTV檢測(cè)引物P1：ATGTGGTATGCTGGATGTTC ，P2 ：GTTCATATTTCCCGCTTTGA 進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL 、P1和P2各1 μL 、 2×Es Taq Master Mix 10 μL 、RNase-free ddH2O 6 μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 6 min、變性94 ℃ 35 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 38 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后， 72 ℃ 10 min終延伸，16 ℃保存。

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1香蕉組織基因組DNA提取結(jié)果

使用優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取20mg、30mg、50mg、70mg、100mg新鮮香蕉葉片,取10μL電泳結(jié)果如圖1所示,濃度及OD值如表1所示。電泳圖顯示不同樣品的泳道都有清晰的基因組DNA條帶,OD值結(jié)果顯示提取產(chǎn)物的濃度和純度都比較高,說明本文使用的DNA提取方法能有效的提取香蕉的DNA。SDS、CTAB和PVP法中SDS法提取量最大(杜道林等，2003)。因此將SDS法提取的香蕉葉片DNA同本試驗(yàn)優(yōu)化的DNA提取方法所提取的香蕉葉片DNA作比較，取10 μL電泳結(jié)果如圖2所示?？梢姳驹囼?yàn)優(yōu)化的方法提取的DNA電泳條帶要比SDS法提取的DNA亮，說明本文的DNA提取效果要好于SDS法的提取效果。

表1 不同重量香蕉樣品DNA提取結(jié)果Table1 DNAextractionresultsofdifferentweightbananasamples樣品重量濃度(ng/μL)OD值20mg108.11.9730mg121.11.9950mg135.81.8470mg124.32.02100mg160.82.01

3.2PCR檢測(cè)BBTV

根據(jù)3.1中的提取結(jié)果顯示，重量為50 mg的香蕉葉提取效果最好，根據(jù)實(shí)際操作情況，50 mg的量的香蕉葉在試驗(yàn)操作中最為方便，因此在本試驗(yàn)PCR檢測(cè)中使用50 mg的量提取DNA作為模板進(jìn)行檢測(cè)。

染病植株新鮮葉片、新鮮莖稈、枯萎葉片、枯萎莖稈PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由于枯葉、枯桿較鮮葉、鮮桿水分散失較多，因此在取樣時(shí)只需取同50 mg的鮮葉或鮮桿面積相同即可。

圖1不同重量香蕉樣品DNA提取的凝膠電泳 圖2兩種方法DNA提取的凝膠電泳

Figure 1Gel electrophoresis of DNA extraction of Figure 2Gel electrophoresis of DNA

different weight banana samples extraction by two methods

M.DNA Marker III； 1-5.重量分別為20 mg、30 mg、 M.DNA Marker III；1、2.SDS法提取的香蕉葉片DNA；

50 mg、70 mg、100 mg新鮮香蕉葉片DNA 3、4.本試驗(yàn)方法提取的香蕉葉片DNA

圖3　PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Figure 3　Gel electrophoresis of PCR products1、2.新鮮葉片PCR產(chǎn)物； 3、4.新鮮莖稈PCR產(chǎn)物；5、6.枯萎葉片PCR產(chǎn)物； 7、8.枯萎莖稈PCR產(chǎn)物

圖4　不同模板的PCR的凝膠電泳Figure 4　Gel electrophoresis of PCR with different templatesM.DNA Marker III； 1-3.模板為SDS法提取的染病香蕉葉片DNA； 4-6.模板為SDS法提取的健康香蕉葉片DNA； 7-9.模板為本文的DNA提取方法提取的染病香蕉葉片DNA； 10-12.模板為本文的DNA提取方法提取的健康香蕉葉片DNA

用SDS法和本文的DNA提取方法提取染病香蕉葉片DNA和健康香蕉葉片DNA，并以之為模板進(jìn)行PCR，對(duì)比結(jié)果如圖4所示。可見兩種方法的PCR結(jié)果基本一致，并且以本文的DNA提取方法提取的DNA為模板的PCR電泳條帶要稍亮一些，說明本文優(yōu)化的DNA提取方法能夠提取出質(zhì)量好的香蕉DNA。

4結(jié)果分析

優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取出的香蕉基因組DNA經(jīng)過電泳后，條帶清晰；從表1的數(shù)據(jù)來看，五個(gè)樣品的濃度都超過100 ng/μl，OD值幾乎都在1.8-2.0之間，或是極為接近這一區(qū)間，這樣的試驗(yàn)結(jié)果說明此方法提取效率很高同時(shí)提取質(zhì)量還很好。

使用優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取出的香蕉基因組DNA作為模板進(jìn)行的PCR結(jié)果也十分理想，不僅得到了大小一致的條帶，而且條帶清晰，尤其是新鮮葉片和新鮮莖稈的結(jié)果十分理想，而枯萎葉片和枯萎莖稈的條帶沒有新鮮的亮，但也大小正確，同樣能都檢測(cè)出植株帶病。

5討論

由于BBTV沒有具體的治療方法，且危害不同的國(guó)家地區(qū)，危害范圍廣，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前BBTV的預(yù)防方法主要是通過組培技術(shù)生產(chǎn)無毒種苗。及時(shí)清除種植區(qū)的毒株，防止發(fā)病植株成為病源使病毒在整個(gè)種植區(qū)蔓延。因而快速、有效并準(zhǔn)確的檢測(cè)出BBTV在生產(chǎn)實(shí)踐中非常重要。本試驗(yàn)就是在此背景下優(yōu)化出一種快速、有效、且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)在DNA的提取上采用了快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒的方法，同時(shí)在試驗(yàn)過程中針對(duì)香蕉的植物學(xué)特性對(duì)其中的一些操作進(jìn)行了合理的優(yōu)化，比如：在打碎樣品時(shí)不能讓樣品離開液氮在鋁盒中晃動(dòng)太久，否則溫度升高，樣品中的多酚多糖等物質(zhì)會(huì)影響DNA的提取質(zhì)量。因此縮短單次打碎樣品的時(shí)間，提高打碎樣品的次數(shù)。同樣，若打成粉末狀的樣品不能及時(shí)進(jìn)行后續(xù)步驟，也應(yīng)低溫保存；加入緩沖液PL1后多放置一分鐘左右，使其裂解更為充分；加入600 μL緩沖液PL2后多放置1 min左右，能夠更加充分的去除多酚多糖等。從而使該DNA提取方法更適合香蕉基因組DNA的提取。

在傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中，ELISA使用的抗體本質(zhì)是蛋白質(zhì)，香蕉中所含的單寧會(huì)使蛋白質(zhì)變性，從而在很大程度上影響試驗(yàn)結(jié)果，降低準(zhǔn)確性；PCR檢測(cè)離不開的DNA需要從香蕉中提取出來。普通的DNA提取方法很難從富含多酚多糖的香蕉中提取出DNA，相對(duì)來說提取效果較好的SDS法、CTAB法也存在高毒、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、液氮研磨易交叉污染等缺陷。本試驗(yàn)中采用并優(yōu)化的快速無毒植物基因組DNA提取方法經(jīng)過試驗(yàn)證明有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是能很好的克服多酚多糖的干擾提取出高質(zhì)量的香蕉基因組DNA；二是本方法使用的是2 mL離心管配合鋼珠打碎樣品，可以很好的避免液氮研磨交叉污染的問題；三是能在香蕉枯萎的葉片和莖稈中提取出基因組DNA，并且能夠進(jìn)行PCR檢測(cè)。而感染BBTV植株會(huì)出現(xiàn)枯死癥狀，那么通過枯死的部位也能夠進(jìn)行檢測(cè)；四是試驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高。

本試驗(yàn)優(yōu)化的快速提取檢測(cè)香蕉束頂病的方法通過試驗(yàn)證明能夠快速、有效、且準(zhǔn)確的提取并檢測(cè)出香蕉束頂病。

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(責(zé)任編輯：陳曉雯)

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A rapid method for extraction and detection of

Banana Bunchy Top Virus (BBTV)

Yun JIANG1， Wei SUN1， Yu-Long ZHANG1,2， Xiao-Juan LIU1,2

(1.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China;

2.FujianProvincalKeyLaboratoryofPlantVirology,Fuzhou,Fujian350002,China)

Abstract:Banana Bunchy Top Virus (BBTV)is a serious and difficult-treating virus in banana. The best way to control BBTV is rooting out virus-effected plants, and detecting the virus rapidly and efficiently becomes very important. BBTV is a single stranded ring DNA virus. In this experiment DNA of banana samples was extracted by a optimized method, and then detection of BBTV by PCR . The results showed that the method optimized is easy to be operated with short time, and the extracted products can be used for the rapid detection of BBTV, which provides a new method for the rapid detection of BBTV.

Key words:Banana Bunchy Top Virus (BBTV); DNA extraction; rapid detection

中圖分類號(hào):Q781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1001-4276-(2015)01-0170-06

作者簡(jiǎn)介：江沄(1994-)，女，學(xué)士。Email：243002689@qq.com。

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué) (2010J01073)。

收稿日期：2015-03-03; 發(fā)表日期：2015-10-31