外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究

劉文瑜，楊宏偉，魏小紅，劉博，王高強(qiáng)，吳偉濤

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究

劉文瑜，楊宏偉，魏小紅*，劉博，王高強(qiáng)，吳偉濤

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：本試驗(yàn)以蒺藜苜蓿種子為材料，預(yù)先用0.1,0.3和1.0 mmol/L 硝普鈉(SNP, NO 供體)浸種，通過計(jì)算相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)，測定種子萌發(fā)過程中各項(xiàng)生理指標(biāo)及抗氧化系統(tǒng)酶活性，研究外源NO對2.0% NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及活性氧代謝的影響。結(jié)果表明,0.1 mmol/L SNP能顯著緩解鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子造成的傷害，使蒺藜苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高了333.40%，79.64%，171.93%和100.00%；種子可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分別提高了21.1%,42.3%和123.1%，淀粉含量降低了17.7%，淀粉酶活性提高了29.7%，丙二醛(MDA)和超氧陰離子(O2-·)含量分別降低了21.8%和27.2%，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性分別增加了28.6%,43.1%,56.2%和60.3%；與0.1 mmol/L SNP處理相比，0.3 mmol/L SNP處理對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)的促進(jìn)、氧化損傷的緩解和抗氧化系統(tǒng)酶活性的提高顯著降低；1.0 mmol/L SNP處理對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發(fā)起到抑制作用。說明低濃度的NO可通過降低種子MDA和O2-·含量，提高種子脯氨酸含量以及激活抗氧化系統(tǒng)酶活性，減輕鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子的傷害，促進(jìn)淀粉、可溶性蛋白的水解，從而加速種子萌發(fā)。

關(guān)鍵詞：一氧化氮；鹽脅迫；蒺藜苜蓿；種子萌發(fā)；抗氧化酶

土壤鹽害已成為影響植物種子萌發(fā)、作物生長和產(chǎn)量的主要生物脅迫之一。鹽害可導(dǎo)致植物體內(nèi)超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基的積累，大量積累的活性氧引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化進(jìn)而造成細(xì)胞損傷。植物則通過提高抗氧化系統(tǒng)酶活性，減輕鹽脅迫的傷害。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是廣泛存在于植物體內(nèi)的氣體小分子信號物質(zhì)。植物體內(nèi)NO的合成主要依賴于一氧化氮合酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)。NO在植物體內(nèi)是致毒還是起到保護(hù)作用取決于胞內(nèi)環(huán)境、作用部位。一方面當(dāng)胞內(nèi)NO濃度高時(shí)，NO可作為一種自由基參與反應(yīng)而破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，對生物體產(chǎn)生氧化損傷；另一方面當(dāng)胞內(nèi)活性氧濃度較低時(shí)，NO可中斷活性氧鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對細(xì)胞起到保護(hù)作用；另外NO在植物生長發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用，包括破除種子休眠、植物體新陳代謝、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用、呼吸作用[10]、成花生理[11]等；在旱害、鹽害、冷害以及病原菌侵染等逆境脅迫應(yīng)答中也起著重要作用[2]。硝普鈉(SNP)是現(xiàn)已廣泛使用的外源NO供體，0.5 mmol/L SNP可以釋放約2.0 μmol/L的NO[2]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的硝普鈉(SNP)處理明顯緩解鹽脅迫下水稻 (Oryzasativa)幼苗根組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)的積累，顯著提高可溶性蛋白含量，并誘導(dǎo)根系抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate, APX)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的上升，而高濃度SNP處理效果則相反[13]；外源NO能提高干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum)幼苗葉片中SOD、POD和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性, 降低超氧陰離子(O2-·)和過氧化氫(H2O2)水平, 緩解膜脂過氧化, 穩(wěn)定生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[14]；外源NO能顯著提高鹽脅迫下番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗葉片抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性及脯氨酸和可溶性糖含量，降低MDA和O2-·含量[15]。

蒺藜狀苜蓿(Medicagotruncatula)為豆科苜蓿屬一年生植物，因其種子莢果螺旋緊密，外被尖刺，形似蒺藜，因此稱為蒺藜狀苜蓿，也稱為截葉苜?；蚪匦诬俎?。蒺藜狀苜蓿原產(chǎn)地中海地區(qū)，在澳大利亞南部許多較為干旱的地區(qū)種植蒺藜苜蓿已非常普遍，我國主產(chǎn)區(qū)為河南、河北、山東、安徽、江蘇、四川、山西、陜西等省[16]。由于蒺藜苜蓿與紫花苜蓿等豆科植物遺傳關(guān)系近，基因組小，生長周期短，有較高的生物多樣性；另外，蒺藜苜蓿固氮效率高，其次生代謝產(chǎn)物豐富，因此，在近年的比較基因組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[17]，而有關(guān)蒺藜苜蓿耐鹽機(jī)制尚未見報(bào)道；同時(shí)，由于近年來土壤鹽漬化加劇，提高蒺藜苜蓿耐鹽性迫在眉睫。為此，本文通過外源NO處理2.0% NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子，對蒺藜苜蓿種子萌發(fā)及種子萌發(fā)過程中可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉、脯氨酸、MDA含量、O2-·產(chǎn)生速率及SOD、POD、CAT和APX活性變化的研究，探討外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)的影響，以期為提高蒺藜苜蓿耐鹽性及揭示其耐鹽性機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)以蒺藜苜蓿品種“WM5106”為材料。由揚(yáng)州大學(xué)提供，千粒重為3.086 g，室溫避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

本試驗(yàn)于2013年4-5月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選大小一致、飽滿且無病蟲害的種子，用0.2%HgCl2溶液浸泡消毒5 min，蒸餾水沖洗5~6次后，分別做如下處理，處理一：分別用不同濃度的NaCl (0，0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%)溶液處理；處理二：分別用蒸餾水，0.1，0.3，1.0 mmol/L SNP溶液浸泡48 h后，用2.0% NaCl處理，即CK、2.0% NaCl、0.1 mmol/L SNP+2.0% NaCl、0.3 mmol/L SNP+2.0% NaCl、1.0 mmol/L SNP+2.0% NaCl。將處理后的種子置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(φ=9 cm)中，每皿50粒種子，每個(gè)處理均重復(fù)3次。以蒸餾水為對照(CK)，每皿中分別加入8 mL對應(yīng)的溶液，將所有培養(yǎng)皿置于溫度(25±1)℃，12 h光照/12 h黑暗、濕度80%恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)幼苗相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)；分別在對處理二(CK、2.0% NaCl、0.1 mmol/L SNP+2.0% NaCl、0.3 mmol/L SNP+2.0% NaCl、1.0 mmol/L SNP+2.0% NaCl)進(jìn)行處理后的第0，2，4，6天測定相關(guān)生理指標(biāo)，并做POD同工酶電泳。

1.2　測定指標(biāo)與方法

1.2.1種子發(fā)芽指標(biāo)萌發(fā)處理后以胚根長為種子長的2倍，胚芽與種子等長作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(發(fā)芽指數(shù)與種子平均鮮重的乘積再除以測試種子的數(shù)量)。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率(GP)=7 d發(fā)芽種子數(shù)/測試種子總數(shù)×100%[18]

發(fā)芽勢(GE)=前3 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%[18-19]

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)[20]

式中，Dt為日發(fā)芽種子數(shù)，Gt為與Dt相應(yīng)的每天的發(fā)芽種子數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[21]

式中，幼苗鮮重為稱取5株幼苗的重量。

1.2.2生理指標(biāo)測定可溶性糖采用蒽酮比色法測定[22]；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定[23]；脯氨酸采用酸性茚三酮法測定[24]；淀粉采用蒽酮比色法測定[22]；淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸法測定[23]；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[24]；超氧陰離子(O2-·)產(chǎn)生速率參照王愛國和羅廣華[25]的方法測定；參照Zhu等[26]，An和Liang[27]的方法提取抗氧化酶酶液，超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Huang等[28]的方法測定；過氧化物酶(POD)活性參照Shi等[29]的方法測定；過氧化氫酶(CAT)活性參照Aebi[30]的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶 (APX)活性參照Nakano和Asada[31]的方法測定。

1.2.3過氧化物同工酶分析采用不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳[32-33]；染色采用改良的聯(lián)苯胺染色法[33-34]。

1.3　數(shù)據(jù)分析

每個(gè)指標(biāo)測定重復(fù)3~5次。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用Sigma Plot 12.5 作圖。

2結(jié)果與分析

2.1　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)的影響

蒺藜苜蓿種子采收當(dāng)年種子硬實(shí)率較高，達(dá)到70%~80%[35]。從表1 可知，與對照相比，隨著NaCl濃度的升高，蒺藜苜蓿種子的發(fā)芽率 (G)、發(fā)芽勢 (GE)、發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù) (VI)均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，不同處理間差異顯著(P<0.05)。其中，0.5%NaCl處理的蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI顯著高于對照和其他處理，分別比對照提高了100.04%，257.51%，28.52%和161.54%；而2.0%NaCl處理的蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI最低，分別比對照降低了78.57%，49.85%，65.77%和92.31%。

表1　不同濃度NaCl 對蒺藜苜蓿種子萌發(fā)的影響

注：同列數(shù)值不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平，下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 5% level, the same below.

從表2 可知，鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI顯著低于對照(CK)(P<0.05)，G、GE、GI和VI分別比CK降低了78.57%，49.85%，65.77%和92.31%。0.1和0.3 mmol/L SNP預(yù)處理顯著提高了鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI，其中，0.1 mmol/L SNP預(yù)處理后，蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI比單獨(dú)鹽處理下提高了333.40%，79.64%，171.93%和100.00%；1.0 mmol/L SNP預(yù)處理下蒺藜苜蓿種子的G和GI顯著低于單獨(dú)用鹽處理，且二者間GE和VI差異不顯著。表明鹽脅迫顯著抑制了蒺藜苜蓿種子的萌發(fā)，低濃度的SNP溶液可以明顯促進(jìn)鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發(fā)，而高濃度的SNP溶液則起到抑制作用。

表2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)的影響

2.2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量變化的影響

如圖1A 所示，鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量顯著降低，并且隨發(fā)芽處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢，在處理的第2、4、6天，分別比CK降低了22.3%，33.1%和27.0%。SNP預(yù)處理提高了鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量，在第2天不同處理下可溶性糖含量達(dá)到最大值，不同濃度SNP與鹽一起處理的比單獨(dú)用鹽處理的分別提高了21.1%，12.6%和5.9%。

如圖1B所示，對照和其他處理下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量隨萌發(fā)時(shí)間的延長先升高后降低，并在第2天達(dá)到最大值。與CK相比，鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量顯著下降，在處理的第2~6天分別比CK降低了27.8%，32.4%和41.1%。與2.0% NaCl處理相比，在處理的第2~6天內(nèi)，不同濃度SNP預(yù)處理顯著提高了鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白的含量，其中0.1 mmol/L SNP預(yù)處理效果最佳，比單獨(dú)鹽脅迫處理分別提高了42.3%，20.0%和54.6%。

如圖1C所示，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中脯氨酸含量先上升后下降，在處理的2~6 d內(nèi)不同處理間差異顯著。鹽脅迫處理顯著增加了種子萌發(fā)過程中脯氨酸含量，并在第4天達(dá)到最大值，比CK增加了19.4%，而后緩慢下降，在整個(gè)處理過程中都始終高于CK。與2.0% NaCl處理相比，不同濃度SNP預(yù)處理顯著提高了鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中脯氨酸含量，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預(yù)處理的種子內(nèi)脯氨酸含量比單獨(dú)用鹽處理的分別提高了123.1%，74.3%和52.0%。

圖1　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中

2.3　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉含量和淀粉酶活性的影響

外源NO對NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子淀粉含量和淀粉酶活性的影響見圖2。從圖2A中可以看出，各處理下蒺藜苜蓿種子內(nèi)淀粉含量隨著發(fā)芽時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢。在整個(gè)處理過程中，用不同濃度SNP與鹽一起處理的種子內(nèi)淀粉含量始終高于CK，但又均顯著低于單獨(dú)用鹽處理；在處理的第2天，各處理組種子內(nèi)淀粉含量差異不顯著；在處理的第4天，各處理下蒺藜苜蓿種子內(nèi)淀粉含量迅速下降，在處理的第6天，各處理下種子內(nèi)淀粉含量仍持續(xù)下降并達(dá)到最低點(diǎn)；其中，0.1 mmol/L SNP與鹽一起處理的種子內(nèi)淀粉含量比單獨(dú)用鹽處理降低了17.7%。

圖2　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉含量(A)和淀粉酶活性(B)的影響Fig.2　Effects of exogenous NO on the starch content(A) and amylase activity(B) in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

相同處理天數(shù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different letters in the same treatment time mean significant difference atP<0.05, the same below.

如圖2B所示，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，蒺藜苜蓿種子內(nèi)淀粉酶活性逐漸升高。種子萌發(fā)過程中，用不同濃度SNP預(yù)處理的種子內(nèi)淀粉酶活性始終顯著高于單獨(dú)用2%NaCl處理，但又均顯著低于CK。在處理的第6天，用0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預(yù)處理的種子內(nèi)淀粉酶活性比單獨(dú)用2%NaCl處理分別高29.7%，19.1%和7.5%。說明用SNP浸種緩解了NaCl脅迫對蒺藜苜蓿種子內(nèi)淀粉酶活性的抑制作用，提高種子內(nèi)淀粉酶活性，從而促進(jìn)淀粉的水解，誘導(dǎo)種子的萌發(fā)。

2.4　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中MDA和O2-·產(chǎn)生速率的影響

由圖3A 可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中MDA 含量逐漸升高，整個(gè)處理過程中，各處理間差異顯著。與CK相比，鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中MDA 含量顯著上升，在第6天達(dá)到最大值，比CK高84.4%。SNP預(yù)處理顯著抑制了鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中MDA含量的增加，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP與鹽一起處理的比單獨(dú)用鹽處理的減少了21.8%，18.2%和13.5%。

由圖3B可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中O2-·產(chǎn)生速率逐漸加快，整個(gè)處理過程中，各處理間差異顯著。鹽脅迫明顯促進(jìn)了種子萌發(fā)過程中O2-·的產(chǎn)生，在處理的第6天，種子萌發(fā)過程中O2-·產(chǎn)生速率達(dá)到最大值，比CK高156.7%。與單獨(dú)用鹽處理相比，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預(yù)處理顯著降低了種子萌發(fā)過程中O2-·的產(chǎn)生速率，在處理的第6天，比鹽脅迫處理分別減小了27.2%，21.1%和14.3%。

以上結(jié)果說明鹽脅迫促進(jìn)了蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中活性氧的積累，而SNP預(yù)處理后顯著緩解了鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子萌發(fā)造成的氧化損傷。

圖3　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中MDA(A)和O2-·產(chǎn)生速率 (B)的影響Fig.3　Effects of exogenous NO on the MDA (A) content and O2-·production rate (B) in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

2.5　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的影響

1) SOD 活性:外源NO對NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中SOD活性的變化如圖4A所示。從圖中可以看出，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，各處理下種子內(nèi)SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。種子萌發(fā)的過程中，對照組種子內(nèi)SOD活性變化較緩，在第2天有小幅上升，到第6天有小幅下降；而種子在經(jīng)過單一的NaCl處理后，SOD活性在第2天到第4天快速上升，同時(shí)期經(jīng)不同濃度SNP處理的種子內(nèi)SOD活性也呈現(xiàn)迅速上升的變化趨勢，其中，0.1 mmol/L SNP預(yù)處理下種子內(nèi)SOD活性最高，比單獨(dú)用NaCl處理顯著提高了90.8%，即使到處理結(jié)束時(shí)，SOD活性雖有下降，但是仍比單獨(dú)用NaCl處理高43.9%。說明SNP預(yù)處理種子可以在一定程度上提高種子萌發(fā)過程中SOD活性。

2) POD活性:如圖4B所示，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，對照組(CK)和其他4種處理下蒺藜苜蓿種子內(nèi)POD活性呈先升高后下降的變化趨勢。在整個(gè)萌發(fā)過程中， CK種子內(nèi)POD變化較為平緩。在第4天，各處理下種子內(nèi)POD活性快速上升，各處理間差異顯著(P<0.05)，并達(dá)到最大值，而且不同濃度SNP+2.0% NaCl處理種子內(nèi)POD活性顯著高于單獨(dú)用2.0%NaCl處理，其中，以0.1 mmol/L SNP處理下種子內(nèi)POD活性最高，比單獨(dú)使用2.0%NaCl處理高30.6%，處理的第6天，不同濃度SNP+2.0%NaCl處理的種子內(nèi)POD活性呈現(xiàn)不同程度的下降，但是仍顯著高于單獨(dú)用2.0%NaCl處理和CK。

3) CAT活性:圖4C顯示，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，在正常條件下，蒺藜苜蓿種子內(nèi)CAT活性呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的變化趨勢(P>0.05)；而在整個(gè)處理過程中，其他各處理下種子內(nèi)CAT活性隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。其中，在處理的第2天，各處理間CAT活性差異不顯著；在第4天，各處理的種子內(nèi)CAT活性迅速上升并達(dá)到最大值，而且不同濃度SNP+2.0%NaCl處理種子內(nèi)CAT活性顯著高于單獨(dú)用2.0%NaCl處理，其中，以0.1 mmol/L SNP處理下種子內(nèi)CAT活性最高，比單獨(dú)使用2.0%NaCl處理高123.9%，處理的第6天，不同濃度SNP+2.0%NaCl各處理下種子內(nèi)CAT活性雖有不同程度下降，但是仍顯著高于單獨(dú)用2.0%NaCl處理和CK。

圖4　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中SOD(A)、POD(B)、CAT(C)及APX (D)活性的影響Fig.4　Effects of exogenous NO on the SOD (A), POD (B), CAT (C) and APX (D) activities in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

4) APX 活性:圖4D顯示，鹽脅迫顯著提高了蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中APX的活性，并且隨著發(fā)芽時(shí)間的延長逐漸升高，在第4天達(dá)到最大值，比CK提高了71.1%，以后緩慢下降，整個(gè)處理過程中，CK中APX活性變化緩慢。與單獨(dú)用鹽處理相比，SNP與鹽一起處理顯著提高了種子萌發(fā)過程中APX的活性，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP與鹽一起處理比單獨(dú)用鹽處理的增加了60.3%，51.5%和39.7%。

圖5　外源NO 調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中POD 同工酶電泳圖譜Fig.5　Effects of exogenous on the POD isoenzyme electrophoresis atlas of M. truncatula germinating seeds under NaCl stress　　　泳道1~3：對照組2,4,6 d；4~6：2% NaCl處理的2，4，6 d；7~9：0.1 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d；10~12：0.3 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d；13~15：1.0 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d。 Lane 1-3: CK 2, 4, 6 d; 4-6: 2% NaCl 2, 4, 6 d; 7-9: 0.1 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d; 10-12: 0.3 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d; 13-15: 1.0 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d.

2.6　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中POD同工酶的影響

如圖5所示，共出現(xiàn)了7條酶帶。其中，A5為共有酶帶，酶帶寬且顏色深。CK的第4和6天出現(xiàn)了A1、A2和A3 3條酶帶，其中A1和A3酶帶較寬且顏色較深，但A2酶帶顏色淺；無論CK、鹽脅迫或SNP與鹽復(fù)合處理，在整個(gè)處理過程中均出現(xiàn)了A4酶帶，但帶較細(xì)且顏色淺；鹽脅迫下A6酶帶顏色加深且?guī)ё儗挘l件下A6酶帶顏色較淺，SNP預(yù)處理的A6酶帶顏色比CK深，卻比單獨(dú)用鹽處理的淺；用CK或SNP預(yù)處理的種子萌發(fā)過程中出現(xiàn)了A7酶帶，但顏色較淺。

3討論

3.1　外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)

種子是植物為躲避惡劣環(huán)境以進(jìn)行種群延續(xù)的一種重要機(jī)制[36]，種子萌發(fā)是植物生活史中的關(guān)鍵過渡階段(從種子到幼苗)[37-38]。種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均可以反映種子發(fā)芽能力。一般情況下， 發(fā)芽率與種子生活力是一致的，因此在生產(chǎn)上通常將種子的發(fā)芽率作為鑒定種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一；發(fā)芽指數(shù)反映了種子發(fā)芽的速率和整齊程度，種子活力是種子在較廣范圍內(nèi)迅速生長及生長整齊度的指標(biāo)[39]。研究表明低濃度的鹽脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長有促進(jìn)作用，高濃度則有抑制作用[40]。本試驗(yàn)結(jié)果表明用0.2%~1.0% NaCl處理蒺藜苜蓿種子后均可以提高種子發(fā)芽率，其中以1.0%的處理最好，而1.5%和2.0%NaCl浸種后種子的發(fā)芽率低于對照，說明低濃度的NaCl可以促進(jìn)蒺藜苜蓿種子萌發(fā)，而高濃度NaCl對種子萌發(fā)起到抑制作用。

SNP是一種常用的外源NO供體。NO作為一種信號分子和活性氧清除劑，能調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)[41]。湯紹虎等[41]研究發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L SNP可以顯著促進(jìn)滲透脅迫下黃瓜(Cucumissativus)種子的萌發(fā)和幼苗生長；Kopyra[42]以外源NO 供體SNP處理羽扇豆(Lupinusluteus)種子, 有效提高了鹽脅迫下種子的萌發(fā)率、萌發(fā)速率及胚根的長度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1和0.3 mmol/L SNP預(yù)處理蒺藜苜蓿種子，可以顯著提高鹽脅迫下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，而1.0 mmol/L SNP預(yù)處理后種子的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)反而低于單獨(dú)用鹽處理。說明低濃度的NO可以促進(jìn)鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發(fā)，而高濃度的NO對種子萌發(fā)起到抑制作用。

3.2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子物質(zhì)代謝的影響

種子萌發(fā)過程中需要物質(zhì)和能量來維持其旺盛的生命活動(dòng)[43]。種子在萌發(fā)期間所需的養(yǎng)料和能量主要來自貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用[44]。種子內(nèi)主要的貯藏物質(zhì)為淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)。這些物質(zhì)在種子萌發(fā)過程中水解為簡單的營養(yǎng)物質(zhì)，并運(yùn)轉(zhuǎn)到生長部位作為構(gòu)成新組織的成分和產(chǎn)生能量的原料[45]。周萬海等[46]研究表明鹽脅迫下添加外源NO可以使甘農(nóng)4號和阿爾岡金2個(gè)苜蓿品種淀粉酶活性顯著提高，淀粉含量降低，可溶性糖含量升高；鄭春芳等[47]研究表明0.1 mmol/L SNP預(yù)處理能顯著提高小麥葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明鹽脅迫顯著降低了淀粉酶活性，抑制了淀粉的水解，抑制了可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加；而0.1和0.3 mmol/L SNP預(yù)處理后顯著降低了種子內(nèi)淀粉含量，提高了淀粉酶活性，增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量。說明外源NO增強(qiáng)了鹽脅迫下種子內(nèi)淀粉酶活性，促進(jìn)了種子內(nèi)淀粉的水解，淀粉僅作為一種暫時(shí)的貯藏物質(zhì)，不斷的水解為可溶性糖以滿足種子萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。

脯氨酸在植物滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用，可以清除活性氧，提高抗氧化能力，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞酸性，解除氨毒等[48]-49。樊懷福等[48]研究表明0.01~0.40 mmol/L SNP 能顯著緩解鹽脅迫對黃瓜植株造成的傷害，提高葉片脯氨酸含量，其中以0.1 mmol/L SNP 緩解效果最好。本試驗(yàn)結(jié)果表明鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中脯氨酸含量顯著上升，不同濃度SNP預(yù)處理后促進(jìn)了種子萌發(fā)過程中脯氨酸含量的積累，其中以0.1 mmol/L SNP 促進(jìn)效果最明顯。說明外源NO預(yù)處理促進(jìn)了鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中脯氨酸的積累，從而緩解了鹽脅迫對種子萌發(fā)造成的抑制作用。

3.3　外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子MDA、O2-·產(chǎn)生及抗氧化酶活性

植物種子萌發(fā)需要的物質(zhì)與能量是由胚乳和糊粉層貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)分解和氧化磷酸化提供的，能量代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，從而對細(xì)胞和組織造成氧化損傷[50]。植物的保護(hù)酶體系在緩解脅迫方面起著重要作用，它可以清除體內(nèi)的活性氧，以避免過量活性氧對植物的傷害[51]。SOD 作為膜保護(hù)的第一道防線，能以O(shè)2-為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)，將毒性較強(qiáng)的O2-轉(zhuǎn)化為毒性較輕的H2O2[52]，而CAT將H2O2歧化為H2O和O2，但是CAT清除H2O2的效率非常低[53]-54，POD則是利用各種基質(zhì)作為電子供體將H2O2還原為H2O[54]-55。POD對CAT起協(xié)同作用[56]。劉建新等[57]研究表明噴施SNP預(yù)處理明顯降低了NaCl脅迫下葉片MDA和O2-·的積累，提高了SOD、POD、CAT和APX活性。孫立榮等[58]研究表明外施SNP顯著緩解了鹽脅迫導(dǎo)致的MDA含量和活性氧水平的增加，提高了鹽脅迫下幼苗葉子中SOD、POD、APX和CAT等抗氧化酶的活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫顯著提高了蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中MDA含量，加快了O2-·產(chǎn)生速率，增加了SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性；不同濃度SNP預(yù)處理蒺藜苜蓿種子后，在種子萌發(fā)過程中MDA含量和O2-·產(chǎn)生速率受到不同程度的降低和抑制，并且顯著增強(qiáng)了SOD、POD、CAT和APX活性；其中以0.1 mmol/L SNP 緩解效果最好。說明外源NO 通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，清除種子萌發(fā)過程中積累的活性氧，減輕鹽脅迫對種子萌發(fā)造成的氧化損失，從而加速種子萌發(fā)。

Reference：

[1]Zhang C P, Li Y C, Yuan F G,etal. Effects of hematin and carbon monoxide on the salinity stress responses ofCassiaobtusifoliaL. seeds and seedlings. Plant Soil, 2012, 359: 85-105.

[2]Sheokand S, Kumari A, Sawhney V. Effect of nitric oxide and putrescine on antioxidative responses under NaCl stress in chickpea plants. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2008, 14(4): 355-362.

[3]Fan H F, Du C X, Ding L,etal. Effects of nitric oxide on the germination of cucumber seeds and antioxidant enzymes under salinity stress. Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 35:2707-2719.

[4]Ren X L, Zhang S Y, Yu J N. Nitric oxide and its role in maturation and senescence in plant. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2004, 24(1): 167-171.

[5]Zhao X D, Yang H Y, Wang Y. Functions of nitric oxide in signal transduction of plant resistance to environmental stress. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2008, 36(22): 9397-9399, 9499.

[6]Zheng C, Jiang D, Liu F,etal. Exogenous nitric oxide improves seed germination in wheat against mitochondrial oxidative damage induced by high salinity.Environmental and Experimental Botany, 2009, 67: 222-227.

[7]Guo F Q, Okamoto M, Crawford N M. Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling. Science, 2009, 302: 100-103.

[9]Takahashi S, Yamasaki H. Reversible inhibition of photophosphorylation in chloroplasts by nitric oxide. Febs Letters, 2002, 512:145-148.

[10]Garcia-Mata C, Lamattina L. Abscisic acid (ABA) inhibits light-induced stomatal opening through calcium and nitric oxide-mediated signaling pathways. Nitric Oxide, 2007, 17: 143-151.

[11]He Y K, Tang R H, Hao Y,etal. Nitric oxide represses theArabidopsisfloral transition. Science, 2004, 305:1968-1971.

[12]Delledonne M, Xia Y, Dixon R A,etal. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature, 1998, 394: 585-588.

[13]Liu K L, Han H R, Xu Y H,etal. Exogenous nitric oxide alleviates salt stress-induced membrane lipid peroxidation in rice seedling roots. Chinese Journal of Rice Science, 2005, 19(4): 333-337.

[14]Li H, Zhao W C, Zhao H J,etal. Effects of exogenous nitric oxide donor sodium nitroprusside on ATPase activity and membrane lipid peroxidation in wheat (TriticumaestivumL. cv. ‘Luohan 6’) seedling leaves under drought stress. Plant Physiology Communications, 2009, 45(5): 455-458.

[15]Wu X X, Zhu Y L, Zhu Y M,etal. Protective effects of exogenous nitric oxide on oxidative damage in tomato seedling leaves under NaCl Stress. Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2006, 22(3): 276-280.

[16]Liu J L, Yun T Y,Cao J M,etal. Effect of acid treatment on seed germination ofMedicagotruncatulagaertn. Seed, 2008, 27(9): 87-88.

[17]Barker D G, Bianchi S, Blondon F,etal.Medicagotruncatula, a model plant for studying the molecular genetics of the Rhizobium-legume symbiosis. Plant Molecular Biology Reporter, 1990, 8: 40-49.

[18]Xue Y F, Shi Z Q, Yan S H,etal. A preliminary study of assessing the feasibility of using physiological and biochemical parameters to assess water hyacinth biogas slurry for soaking seeds to improve germination characteristics. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(5): 51-56.

[19]Gao C F, Wen B Q, Wang Y X,etal. Allelopathy of Chamaecrista spp onPaspalumnotatumunder aluminum and magnesium stress. Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(5): 40-45.

[20]Li B B, Wei X H, Xu Y. The causes ofGentianastramineaMaxim.seeds dormancy and the methods for its breaking. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(15): 4631-4638.

[21]Jiang Y B, Zheng Q H, Wang C Z,etal. Effects of ultradrying storage on vigor and antioxidase activity ofCichoriunintybusseeds. Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(5): 93-97.

[22]Zou Q. Plant Physiology Experimental Guide. Beijing: China Agriculture Press, 2000.

[23]Li H S. Plant Physiological and Biochemical Principle and Technology. Beijing: Higher Education Press, 2000.

[24]Yu M, Zhou S B, Wu X Y,etal. Dormancy break approaches and property of dormant seeds of wildCryptotaeniajaponica. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(4): 1347-1354.

[25]Wang A G, Luo G H. Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants. Plant Physiology communication, 1990, 26(2): 55-57.

[26]Zhu Z B, Liang Z S, Han R L. Saikosaponin accumulation and antioxidative protection in drought-stressedBupleurumchinenseDC. Plants. Environment and Experimental Botany, 2009, 66:326-333.

[27]An Y Y, Liang Z S. Drought tolerance ofPeriplocasepiumduring seed germination: antioxidant defense and compatible solutes accumulation. Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 8(7): 1-8.

[28]Huang X S, Liu J H, Chen X J. Overexpression of PtrABF gene, a bZIP transcription factor isolated fromPoncirustrifoliata, enhances dehydration and drought tolerance in tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes. BMC Plant Biology, 2010, 10: 230.

[29]Shi S, Fu X Z, Peng T,etal. Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of citrus in vitro plants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response. Tree Physiology, 2010, 30: 914-922.

[30]Aebi H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 1984, 105:121-126.

[31]Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascor bate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology, 1981, 22(5): 867-880.

[32]Hu N S, Wan X G. Isoenzyme Technique and Application. Changsha: Hunan Science and Technology Press, 1985.

[33]Liang H W,Liu S, Chen F J,etal. Development of peroxidase and isoesterase isozymes during seed germination ofTapisciasinensisOliv. Seed, 2006, 25(5): 38-40.

[34]He Z X, Zhang S Z. Electrophoresis (the second press). Beijing: Science Press, 1990.

[35]Wei Z W, Gai J Y. Model legume:Medicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(1): 114-120.

[36]Zong W J, Liu K, Bu H Y,etal. The mode of seed size variation and the effects of seed size on fifty-one species of composite plants in a alpine meadow. Journal of Lanzhou University (Natural Sciences), 2006, 42: 52-55.

[37]Lu J H, Lv X, Wu L,etal. Germination responses of three medicinal licorices to saline environments and their suitable ecological regions. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(2): 195-202.

[38]Lu Y M, Su C Q, Li H F. Effects of different salts stress on seed germination and seedling growth ofTrifoliumrepens. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(4):123-129.

[39]Cai X Y, Chen X D, Li C Z,etal. Effects of exogenous Ca2+on the seed germination ofKoelreuteriapaniculatain limestone area of Southwest China under drought stress. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(5): 1341-1346.

[40]Khan M S A, Hamid A, Karim M. Effects of sodium chloride on germination and seedling characters of different types of rice (OryzasativaL.).Journal of Agronomy and Crop Science, 1997, 179:163-169.

[41]Tang S H, Zhou Q G, Sun M,etal. Effects of exogenous nitric oxide on seed germination, seedling growth and physiological characteristics of cucumber under osmotic pressure. Scientia Agricultural Sinica, 2007, 40(2):419-425.

[42]Kopyra E A. Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth ofLupinusluteus. Physiology and Biochemistry, 2003, 41: 1011-1017.

[43]Chai J R. The amylase and sugars trends of different type tobacco seed at germination time. Seed, 2006, 25(10): 9-12.

[44]Tang J, Hou L X, Che Y M,etal. The effects of exogenous salicylic acid and nitric oxide on maize seed germination and the activity of amylase. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2007, 13(19): 40-42.

[45]Zheng G H, Shi Z L, Zhao T F,etal. Seed Physiology. Beijing: Agriculture Press, 1990: 113, 123, 240.

[46]Zhou W H,Shi S L, Kou J T. Effect of nitric oxide on alfalfa seed germination under NaCl stess. Jouenal of Nucera Agricultural Sciences, 2012，26(4): 710-716.

[47]Zheng C F, Jiang D, Dai T B,etal. Effects nitroprusside,a nitric oxide donor, on carbon and nitrogen metabolism and the activity of the antioxidation system in wheat seedlings under salt stress. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(5):1174-1183.

[48]Fan H F, Guo S R, Jiao Y S,etal. The effects of exogenous nitric oxide on growth, active oxygen metabolism and photosynthetic characteristics in cucumber seedlings under NaCl stress. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(2):546-563.

[49]Gao H N, Ma G T, Li C X,etal. Effects of a microorganism on grass physiological and biochemical characteristics when grown in Cr (Ⅵ) polluted soil. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(4): 189-194.

[50]Li J, Wu H M,Chen H P. Exogenous carbon monoxide and nitric oxide alleviate the oxidative damage in rice seed germination under drought stress. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2011, 31(4): 731-738.

[51]Zhang H S, Zhao G Q, Li M F,etal. Physiological responses ofPennisetumlongissimiumvar. intermedium seedlings to PEG, low temperature and salt stress treatments. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(2): 180-188.

[52]Li X, Wu Y J, Sun L X. Growth and physiological responses of three warm-season turfgrasses to lead stress. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(4): 171-180.

[53]Zhang W W, Zhen F X, Wang X K,etal. Effects of ozone on root activity, soluble protein content and antioxidant system inOryzasativaroots. Journal of Plant Ecology, 2009, 33(3): 425-432.

[54]Lie G W, Ye L H, Xue Y L. Effects of ozone stress on major plant physiological functions. Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(2): 294-306.

[55]Kim Y H, Lim S, Han S H,etal. Differential expression of 10 sweetpotato peroxidases in response to sulfur dioxide, ozone, and ultraviolet radiation. Plant Physiology and Biochemistry, 2007, 45(12): 908-914.

[56]Ma S L. Study on the Dormancy Merchanism ofAcanthopanaxSenticosusSeeds. Changchun: Jilin Agricultural University, 2006.

[57]Liu J X, Wang X, Li B P. Effects of exogenous nitric oxide donor SNP on protecting Peganum multisectum seedlings from oxidative damage under NaCl stress. Agricultural Research in the Arid Areas, 2009, 27(6): 139-143.

[58]Sun L R, Hao F S, Lv J Z,etal. Effects of exogenous nitric oxide on growth and physiological characteristics of ryegrass seedlings under salt stress. Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(11):5714-5722.

參考文獻(xiàn)：

[4]任小林, 張少穎, 于建娜. 一氧化氮與植物成熟衰老的關(guān)系. 西北植物學(xué)報(bào), 2004, 24(1): 167-171.

[5]趙曉丹, 楊紅玉, 王媛.一氧化氮在植物抗逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(22): 9397-9399, 9499.

[13]劉開力, 韓航如, 徐穎潔, 等. 外源一氧化氮對鹽脅迫下水稻根部脂質(zhì)過氧化的緩解作用. 中國水稻科學(xué), 2005, 19(4): 333-337.

[14]李慧, 趙文才, 趙會(huì)杰, 等. 外源一氧化氮供體硝普鈉對干旱脅迫下小麥幼苗葉中ATP 酶活性和膜脂過氧化的影響. 植物生理學(xué)通訊, 2009, 45(5): 455-458.

[15]吳雪霞, 朱月林, 朱為民, 等. 外源一氧化氮對NaCl脅迫下番茄幼苗葉片氧化損傷的保護(hù)效應(yīng). 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22(3): 276-280.

[16]劉建利, 云天運(yùn), 曹君邁, 等. 酸處理對蒺藜狀苜蓿種子萌發(fā)的影響. 種子, 2008, 27(9): 87-88.

[18]薛延豐, 石志琦, 嚴(yán)少華, 等. 利用生理生化參數(shù)評價(jià)水葫蘆沼液浸種可行性初步研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(5): 51-56.

[19]高承芳, 翁伯琦, 王義祥, 等. 鋁、鎂離子脅迫下決明對百喜草的化感作用. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(5): 40-45.

[20]李兵兵, 魏小紅, 徐嚴(yán). 麻花秦艽種子休眠機(jī)理及其破除方法. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 33(15): 4631-4638.

[21]姜義寶, 鄭秋紅, 王成章, 等. 超干貯藏對菊苣種子活力與抗氧化性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(5): 93-97.

[22]鄒琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 62-174.

[23]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù). 北京: 高等教育出版社, 2000: 169-184.

[24]喻梅, 周守標(biāo), 吳曉艷, 等. 野生鴨兒芹種子休眠特性及破除方法. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 32(4): 1347-1354.

[25]王愛國,羅廣華. 植物的超氧自由基與羥胺反應(yīng)的定量關(guān)系. 植物生理學(xué)通訊, 1990, 26(2): 55-57.

[32]胡能書, 萬賢國. 同工酶技術(shù)及其應(yīng)用. 長沙: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 1985： 3-105.

[33]梁宏偉, 劉姝, 陳發(fā)菊, 等. 銀鵲樹種子萌發(fā)過程中的過氧化物酶和酯酶同工酶的變化. 種子, 2006, 25(5): 38-40.

[34]何忠效, 張樹政. 電泳(第二版). 北京： 科學(xué)出版社, 1999.

[35]魏臻武, 蓋鈞鎰. 豆科模式植物——蒺藜苜蓿. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(1): 114-120.

[36]宗文杰, 劉坤, 卜海燕, 等. 高寒草甸51種菊科植物種子大小變異及其對種子萌發(fā)的影響研究. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 42: 52-55.

[37]陸嘉惠, 呂新, 吳玲, 等. 三種藥用甘草種子對鹽漬環(huán)境的萌發(fā)響應(yīng)及其適宜生態(tài)種植區(qū). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22(2): 195-202.

[38]盧艷敏, 蘇長青, 李會(huì)芬. 不同鹽脅迫對白三葉種子萌發(fā)及幼苗生長的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22(4):123-129.

[39]蔡喜悅, 陳曉德, 李朝政,等. 干旱脅迫下外源鈣對石灰?guī)r地區(qū)復(fù)羽葉親樹種子萌發(fā)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(5): 1341-1346.

[41]湯紹虎, 周啟貴, 孫敏, 等. 外源NO 對滲透脅迫下黃瓜種子萌發(fā)、幼苗生長和生理特性的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,40(2): 419-425.

[43]柴家榮. 不同煙草類型種子萌發(fā)期淀粉酶及糖類物質(zhì)動(dòng)態(tài)研究. 種子, 2006, 25(10): 9-12.

[44]唐靜, 侯麗霞, 車永梅, 等. 外源水楊酸與一氧化氮對玉米種子萌發(fā)及淀粉酶活性的影響. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 13(19): 40-42.

[45]鄭光華, 史忠禮, 趙同芳,等.實(shí)用種子生理學(xué). 北京:農(nóng)業(yè)出版社, 1990: 113, 123, 240.

[46]周萬海, 師尚禮, 寇江濤. 一氧化氮對NaCl 脅迫下苜蓿種子萌發(fā)的影響. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2012，26(4): 710-716.

[47]鄭春芳, 姜東, 戴廷波, 等. 外源一氧化氮供體硝普鈉浸種對鹽脅迫下小麥幼苗碳氮代謝及抗氧化系統(tǒng)的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(5): 1174-1183.

[48]樊懷福, 郭世榮, 焦彥生, 等. 外源一氧化氮對NaCl脅迫下黃瓜幼苗生長、活性氧代謝和光合特性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 27(2): 546-563.

[49]高海寧, 馬國泰, 李彩霞, 等. 菌劑對鉻(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗生理生化的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(4): 189-194.

[50]李江, 吳黃銘, 陳惠萍. 外源CO和NO對水稻種子萌發(fā)過程中干旱脅迫損傷的緩解效應(yīng). 西北植物學(xué)報(bào), 2011, 31(4): 731-738.

[51]張懷山, 趙桂琴, 栗孟飛, 等. 中型狼尾草幼苗對PEG、低溫和鹽脅迫的生理應(yīng)答. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(2): 180-188.

[52]李西, 吳亞嬌, 孫凌霞. 鉛脅迫對三種暖季型草坪草生長和生理特性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(4): 171-180.

[53]張巍巍, 鄭飛翔, 王效科,等. 臭氧對水稻根系活力、可溶性蛋白含量與抗氧化系統(tǒng)的影響. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 33(3): 425-432.

[54]列淦文, 葉龍華, 薛搖立. 臭氧脅迫對植物主要生理功能的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(2): 294-306.

[56]馬淑蘭. 刺五加種子休眠機(jī)理研究. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[57]劉建新, 王鑫, 李博萍. 外源一氧化氮供體SNP對NaCl脅迫下多裂駱駝蓬幼苗氧化損傷的保護(hù)效應(yīng). 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2009, 27(6): 139-143.

[58]孫立榮, 郝福順, 呂建洲, 等. 外源一氧化氮對鹽脅迫下黑麥草幼苗生長及生理特性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(11): 5714-5722.

Effects of exogenous nitric oixde on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism ofMedicagotruncatulaunder NaCl stress

LIU Wenyu, YANG Hongwei, WEI Xiaohong*, LIU Bo, WANG Gaoqiang, WU Weitao

CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:Medicago truncatula seeds were pre-soaked with 0.1, 0.3 and 1.0 mmol/L sodium nitriprusside [SNP, a nitric oxide (NO) donor] solution to study the effects of nitric oxide on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism of M. truncatula under 2.0% NaCl stress. Damage to M. truncatula seeds caused by 2.0% NaCl stress was significantly alleviated in the presence of 0.1 mmol/L SNP. The seed germination percentage, germination energy, germination index and vigor index were increased 333.40%，79.64%，171.93% and 100.00%, respectively; while soluble sugar, protein and proline contents in seeds were increased by 21.1%, 42.3% and 123.1%, respectively. Starch content was decreased by 17.7%, amylase activity was increased by 29.7%, and MDA and O2-·contents were decreased by 21.8% and 27.2%, respectively. Activities of SOD, POD, CAT and APX in seeds were increased by 28.6%, 43.1%, 56.2% and 60.3%, respectively. Seed germination, oxidative damage and the antioxidant enzyme activities in seeds decreased when seeds were treated with 0.3 mmol/L SNP. When the concentration of SNP solution was increased to 1.0 mmol/L, we observed an inhibitory effect on seed germination. Our results provide evidence that lower concentrations of SNP may alleviate damage to seeds caused by salt stress. Key components of the response are: decreased MDA and O2-·levels, increased proline level and antioxidant enzyme activities in seeds, with resultant promotion of starch and protein hydrolysis, expedition of seed germination.

Key words:nitric oxide; salt stress; Medicago truncatula; seed germination; antioxidant enzyme

*通訊作者

Corresponding author. E-mail:weixh@gsau.edu.cn

作者簡介：劉文瑜(1985-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士。E-mail:yu850721.lemon@163.com

基金項(xiàng)目：甘肅省自然基金項(xiàng)目(2014GS04173)資助。

*收稿日期：2014-07-03；改回日期：2014-09-02

DOI：10.11686/cyxb20150211

http://cyxb.lzu.edu.cn

劉文瑜， 楊宏偉， 魏小紅， 劉博， 王高強(qiáng)， 吳偉濤. 外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2015， 24(2)： 85-95.

Liu W Y, Yang H W, Wei X H, Liu B, Wang G Q, Wu W T. Effects of exogenous nitric oixde on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism ofMedicagotruncatulaunder NaCl stress. Acta Prataculturae Sinica， 2015， 24(2)： 85-95.