• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)

    2015-02-24 08:35:54陳勇龍黃華榮唐平平羊雪芹李斐雪張遵義
    關(guān)鍵詞:基因編輯基因修飾

    陳勇龍,黃華榮,唐平平,羊雪芹,李斐雪,許 杰,張遵義

    (1.杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所,浙江 杭州 310036;2.石門中心衛(wèi)生院,浙江 嘉興 314512)

    基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)

    陳勇龍1,黃華榮1,唐平平2,羊雪芹1,李斐雪1,許杰1,張遵義1

    (1.杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所,浙江 杭州 310036;2.石門中心衛(wèi)生院,浙江 嘉興 314512)

    摘要:基因定點編輯技術(shù)包括基于胚胎干細(xì)胞及同源基因片段重組的基因打靶技術(shù)、鋅指結(jié)構(gòu)(ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(TALEN)以及CRISPR/Cas系統(tǒng).CRISPR/Cas系統(tǒng)具有操作簡單、突變率高、成本低,同時可針對多個基因等優(yōu)點;該技術(shù)可進(jìn)行定點修飾, 如敲除、插入、替換等.目前CRISPR/Cas系統(tǒng)已成功應(yīng)用到小鼠、人類細(xì)胞、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻和猴等.文章將對基因修飾技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)做統(tǒng)一梳理,并將系統(tǒng)闡述CRISPR/Cas系統(tǒng)的原理、應(yīng)用以及該技術(shù)的優(yōu)缺點.

    關(guān)鍵詞:基因修飾;CRISPR/Cas系統(tǒng);基因編輯

    從20世紀(jì)50年代沃森和克里克揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)開始,人們真正從分子水平認(rèn)識了基因,開啟了通過改造基因來改造生物的科學(xué)實踐.1980年,Gordon利用顯微注射的方法獲得了第一例轉(zhuǎn)基因小鼠,標(biāo)志著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立,也是基因編輯技術(shù)的開始[1].

    基因編輯技術(shù)是人們開啟認(rèn)識基因功能的鑰匙.早期研究基因功能主要是利用隨機(jī)插入方式將外源基因整合到生物體內(nèi)或是通過同源重組方式刪除目的基因(圖1),以獲得遺傳動物修飾模型,這些技術(shù)有諸多不利如周期長、成本高、技術(shù)體系復(fù)雜等;隨著人類基因組計劃的完成,將已知基因的序列與功能聯(lián)系在一起的功能基因組學(xué)研究成為后基因組時代的一大研究熱點.2012入選《Science》十大重要科學(xué)進(jìn)展之一——基因組編輯技術(shù)[2],方便了研究者構(gòu)建基因修飾模型生物;這些技術(shù)可分為三類:鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)與Cas蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/Cas).這些技術(shù)的應(yīng)用提高了基因編輯的效率,大大縮短模型生物建立的周期,方便對基因功能的研究.

    1傳統(tǒng)基因修飾技術(shù)

    傳統(tǒng)的基因修飾技術(shù)主要是利用隨機(jī)導(dǎo)入方式將目的基因整合到基因組上而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因機(jī)體[1],以及基于胚胎干細(xì)胞與同源基因片段重組的基因打靶方式敲除目的基因而得到轉(zhuǎn)基因機(jī)體[3](圖1).該技術(shù)是過去幾十年并延續(xù)至今的研究基因功能及基因產(chǎn)物與關(guān)聯(lián)疾病機(jī)理的手段.但是這種基因修飾技術(shù)對實驗技術(shù)要求高,時間和資金投入大等缺點限制了其發(fā)展,而近些年來興起的基因組編輯技術(shù)可對目的基因進(jìn)行定點插入或刪除,同時操作步驟更簡化,周期和費用大大降低.

    a.同源重組方式刪除目的基因;b.隨機(jī)插入方式整合到基因組圖1 傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理Fig. 1 The theory of traditional transgenic technology

    2基因組編輯技術(shù)

    基因組編輯技術(shù)主要是通過核酸酶在DNA靶位點引起DNA雙鏈斷裂,激活細(xì)胞內(nèi)DNA兩種修復(fù)機(jī)制:非同源末端連接(Non-homologous End Joining, NHEJ)和同源重組(Homologous Recombination, HR),對靶點DNA進(jìn)行修復(fù).核酸酶主要依賴于蛋白質(zhì)或RNA與非特異性內(nèi)切酶的組合對目的DNA序列進(jìn)行切割.目前已經(jīng)成熟應(yīng)用的基因組編輯核酸酶有鋅指核酸酶(ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(TALENs),以及2013年以來一項新興的基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng),該系統(tǒng)已逐漸成熟并成功應(yīng)用到多種生物,促進(jìn)了基因功能的研究.

    ZFN和TALEN兩個系統(tǒng)的核酸酶分別依靠于鋅指蛋白和類轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的特異性識別DNA序列,然后依靠非特異性的FokI內(nèi)切酶切割DNA.Yang等利用ZFNs技術(shù)研究導(dǎo)致動脈硬化癥的ApoCIII基因,設(shè)計了8對針對ApoCIII基因的第二個外顯子2的 ZFNs,將mRNA注射到兔的受精卵,體外培養(yǎng)結(jié)果顯示ApoCIII基因突變高達(dá)50%,體內(nèi)驗證ApoCIII突變達(dá)到23.8%[4].Luo等針對中國黃牛的肌生成抑制蛋白基因MSTN設(shè)計了一對ZFNs,靶點位于MSTN的第一個外顯子上,胚胎鑒定結(jié)果顯示,靶點突變率達(dá)20%,等位基因發(fā)生突變達(dá)8.3%[5].Wilson 等使用SSA技術(shù)針對人端粒反轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT設(shè)計了5對特異性的ZFNs,將700 ng ZFN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi),靶點突變達(dá)18.5%[6].ZFN不僅可以修飾目的基因,還可以用于疾病的治療.Xavier等利用借助腺病毒將ZFN和同源序列注射到小鼠腹腔,通過DNA同源重組修復(fù)機(jī)制將突變基因hF9修復(fù),以達(dá)到治愈乙型血友病[7].同時Soldner在干細(xì)胞水平利用ZFN技術(shù)將突變的α-突觸核蛋白基因功能恢復(fù)正常,該基因的點突變會造成帕金森綜合癥[8].H?her等利用ZFN技術(shù)成功使皮膚起泡致病基因失活,并且發(fā)現(xiàn)高劑量的ZFN對皮膚干細(xì)胞沒有傷害同時仍具有再生活力[9].由此可看出,ZFN在人類疾病的治療方面具有很大的潛力;目前,ZFN進(jìn)行基因治療已應(yīng)用到臨床階段.ZFN在基因編輯方面表現(xiàn)出色,但自身缺點限制了其發(fā)展(表1),因此,需要一種更為方便的技術(shù)解決ZFN的缺點.

    表1 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)特點

    TALEN蛋白和真核生物的轉(zhuǎn)錄因子類似,識別特定的DNA序列調(diào)控基因的表達(dá).歐光朔等利用TALEN技術(shù)修飾線蟲表皮膠原蛋白基因dpy-5,導(dǎo)致線蟲體型較小[10].馬三垣等利用TALEN技術(shù)修飾家蠶的BmBlos2,發(fā)現(xiàn)對目的基因的修飾高達(dá)60%,同時還發(fā)現(xiàn)利用一對TALEN同時注射可以刪除大片段的核苷酸序列[11].劉海亮等針對關(guān)聯(lián)Rett綜合癥發(fā)病基因Mecp2設(shè)計TALEN,將TALEN質(zhì)粒注射到猴受精卵內(nèi)成功將該基因修飾,得到表型與人的Rett綜合癥一致[12].Takada等利用TALEN技術(shù)成功將miR-10a敲除,該技術(shù)是在microRNA的前體上進(jìn)行修飾,造成成熟的microRNA功能喪失[13].TALEN技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到大多數(shù)模式生物,例如猴[12]、果蠅[14]、小鼠[7]、線蟲[10]和斑馬魚[15]等等,可見該技術(shù)沒有物種特異性.雖然無論從時間還是資金方面,TALEN比ZFN較具有優(yōu)勢(見表1),但是TALEN也存在著不足之處:識別目的基因的成分是蛋白質(zhì),構(gòu)建識別20 bpDNA的TALEN蛋白可能需要上千個氨基酸,對機(jī)體來說可能會產(chǎn)生免疫反應(yīng)降低TALEN效率.如何高效、廉價、快速地構(gòu)建研究模型,是很多研究者共同關(guān)心的話題.CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)滿足了研究者的這一需求.

    3CRISPR/Cas系統(tǒng)

    3.1 CRISPR發(fā)現(xiàn)歷史及類型

    CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)于1987年,日本研究者在研究EcoliK12堿性磷酸酶序列附近發(fā)現(xiàn)了成簇的短的間隔重復(fù)序列[16];Grissa等研究表明,大約有40%的細(xì)菌和90%的古生菌的基因組都存在這種序列,定位于染色體或質(zhì)粒上[17].細(xì)菌和古生菌內(nèi)的CRISPR/Cas系統(tǒng)主要用于抵御病毒或噬菌體的入侵,是它們進(jìn)化形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng).CRISPR/Cas的組成序列很保守,這些短的重復(fù)序列被短的可變序列所間隔.CRISPR/Cas系統(tǒng)內(nèi),Cas蛋白將入侵的DNA切割為短的序列并整合到細(xì)菌或古生菌的基因組內(nèi),這些序列插入到重復(fù)序列之間,當(dāng)病毒或噬菌體再次入侵時,細(xì)菌或古生菌以整合到基因組的序列為模板轉(zhuǎn)錄為crRNA, crRNA引導(dǎo)Cas蛋白切割入侵的細(xì)菌或古生菌的DNA序列.目前已知的Cas蛋白家族已超過40個,他們在crRNA形成、外源DNA的整合以及剪切外源DNA發(fā)揮重要作用.根據(jù)Cas基因序列及蛋白結(jié)構(gòu),可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型:I型、II型和III型.I型和III型較復(fù)雜,需要多個cas蛋白形成復(fù)合物才能切割靶DNA鏈,而II型只需要一個Cas9蛋白即可對DNA鏈進(jìn)行切割,因此II型也是目前被成功改造的人工核酸酶[18].本文將以II型CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行重點闡述:II型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅含有一個Cas9蛋白和一段20 bp的sgRNA序列,sgRNA用于識別目的序列,Cas9指導(dǎo)前體crRNA的成熟和外源DNA或質(zhì)粒的降解.Cas9蛋白由1 409個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì),包括N端的類Ruc核酸酶結(jié)構(gòu)域和中部NHN核酸酶結(jié)構(gòu)域,NHN結(jié)構(gòu)域可切割與crRNA互補(bǔ)配對的模板鏈,切割位點在PAM序列上游4 bp的位置;Ruc結(jié)構(gòu)域可對另一條鏈進(jìn)行切割,切割位點在PAM序列上游3~8 bp(圖2).

    注:綠色部分為RuvC結(jié)構(gòu)域,粉色部分為HNH結(jié)構(gòu)域;↓為DNA序列斷裂位點;黃色序列為sgRNA,藍(lán)色為PAM序列,紅色序列為chimeric guide RNA折疊序列圖2 CRISPR/Cas9 模式圖Fig. 2 The CRISPR/Cas9 model

    3.2 CRISPR/Cas9作用原理

    II型CRISPR/Cas系統(tǒng)編碼tracrRNA,tracrRNA指導(dǎo)RNaseIII和crRNA前體的成熟;成熟的crRNA與tracrRNA互補(bǔ)配對形成RNA二聚體,介導(dǎo)Cas9蛋白對靶位點進(jìn)行切割,造成DNA雙鏈的斷裂,引起體內(nèi)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制包括插入/缺失引起的末端連接和同源重組修復(fù)機(jī)制(圖2).插入/缺失機(jī)制會造成原序列缺少一些堿基或在原序列引入一些堿基,無論何種情況都會引起目的基因突變,可能使該基因失去功能.而同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)機(jī)制,利用CRISPR/Cas系統(tǒng)將DNA雙鏈切斷,通過引入的一段與目的基因同源序列進(jìn)行同源交換以達(dá)到修復(fù)目的基因.大量實驗證明,CRISPR/Cas9是最行之有效的基因編輯工具,已廣泛應(yīng)用于基因組編輯、基因治療以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控.

    3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用

    CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方面具有優(yōu)勢,就II型系統(tǒng)來說僅需要一段20 bp的DNA序列和Cas9蛋白.目前,已有商品化的質(zhì)粒供研究者選擇,僅需將20 bp的sgRNA克隆到CRISPR/Cas9質(zhì)粒即可.Wang等利用該技術(shù)將Cas9 mRNA和sgRNA注射到小鼠的受精卵,結(jié)果顯示80%都發(fā)生了等位基因的突變;CRISPR/Cas9系統(tǒng)打破了在基因組編輯方面一次僅能編輯一個基因的格局,該文章作者設(shè)計5個不同基因的sgRNA的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tet1、Tet2、Tet3和Sry、Uty同時被編輯且效率很高,這對于研究基因家族成員的功能相關(guān)性至關(guān)重要[19].同樣的結(jié)果在斑馬魚[20]、人體細(xì)胞[21]、線蟲[22]、大鼠[23]和猴[24]等也得到了驗證.單奇?zhèn)サ壤肅RISPR/Cas技術(shù)對水稻OsPDS、OsMPK2 以及OsBADH2基因進(jìn)行改造得到了這3個基因的突變株,這對于作物性狀改良及分子定向育種非同尋常[25].

    基因能否正常發(fā)揮功能,取決于在轉(zhuǎn)錄水平能否正常轉(zhuǎn)錄.在轉(zhuǎn)錄水平研究基因,對了解功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有意義.由于CRISPR/Cas系統(tǒng)具有定向識別作用,當(dāng)sgRNA和Cas蛋白形成復(fù)合物結(jié)合到DNA序列上后,復(fù)合體的結(jié)合解開DNA雙鏈可能導(dǎo)致RNA酶及轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合到DNA序列使得轉(zhuǎn)錄受阻.Lei等利用此原理設(shè)計兩個sgRNA,一個結(jié)合在編碼紅色熒光蛋白的序列,另一個結(jié)合在編碼綠色熒光蛋白的序列,兩個蛋白表達(dá)互不干擾的情況下,將兩個sgRNA和Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)兩種蛋白熒光強(qiáng)度均大幅度下調(diào)[26].Gilbert等將抑制因子及激活因子和Cas9蛋白共同表達(dá),結(jié)果顯示在人的細(xì)胞系和酵母細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄明顯受到抑制或激活;將轉(zhuǎn)錄抑制因子和Cas9蛋白耦合表達(dá),發(fā)現(xiàn)很多基因表達(dá)受到抑制[27].因此,iCRISPR (interfere CRISPR )系統(tǒng)是個特異性極強(qiáng)的工具,在不改變傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)上調(diào)控基因的表達(dá).

    CRISPR/Cas不僅可以調(diào)控基因的表達(dá),還可校正突變基因.Urnov等利用ZFN技術(shù)在細(xì)胞水平校正了鐮刀狀貧血病和乙型血友病的突變基因片段,盡管致病基因得到校正,但是通過腺病毒感染人細(xì)胞從而將ZFN和同源序列引入細(xì)胞[28].然而,CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基因治療提供了一個新的、有力的技術(shù)手段.CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因治療的原理在于同源介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制,將正確的序列替換下突變的序列,從而治愈疾病.李勁松課題組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將小鼠白內(nèi)障遺傳病治愈[29]; Schwank等利用該技術(shù)校正人干細(xì)胞中一種與囊腫性纖維化相關(guān)聯(lián)的基因缺陷[30].Ebina等利用該技術(shù)將HIV-1啟動子沉默,在感染CRISPR/Cas9質(zhì)粒的人干細(xì)胞細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HIV-1表達(dá)明顯下降[31].因此,可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對一些難以治愈的疾病進(jìn)行基因修復(fù),以恢復(fù)其正常功能.

    3.4 CRSIPR/Cas系統(tǒng)利弊

    人工核酸酶最吸引人的地方在于個性化的定制及對基因組進(jìn)行定點修飾.目前這三種人工核酸酶在基因組改造方面都有著很高的編輯效率.CRISPR/Cas系統(tǒng)相較于ZFN和TALEN有著明顯的優(yōu)勢:1.CRISPR/Cas系統(tǒng)比ZFN和TALEN在基因組中分布范圍廣,每8 bp就有一個靶點,而TALEN 1/125 bp,ZFN 1/500 bp;2.CRISPR/Cas系統(tǒng)可以一次對多個基因進(jìn)行定點修飾,而ZFN和TALEN則需要多對;3.CRISPR/Cas系統(tǒng)性價比高,僅需將一段20 bp的sgRNA克隆到表達(dá)質(zhì)粒上即可,ZFN和TALEN目前都被公司壟斷——成本高,且需要各種組裝——操作復(fù)雜;4.II型CRISPR/Cas系統(tǒng)易于改造,將Cas9蛋白功能域NHN結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域中的一個進(jìn)行突變,突變的Cas9蛋白只能切割DNA單鏈,增加缺陷基因被修復(fù)的概率;雙突變可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá);還可將其他功能蛋白加到Cas9蛋白末端,例如將轉(zhuǎn)錄抑制因子連接到Cas9蛋白末端等,用于抑制基因轉(zhuǎn)錄[27].因此,研究人員有待對CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行深入研究,使其具有更廣泛的實用性及高效性.

    基因組編輯技術(shù)在基因修飾方面有著重要作用,特別是CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物模型構(gòu)建方面的優(yōu)勢更是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)無法達(dá)到的.但無論ZFN還是TALEN,以及性價比很高的CRISPR/Cas系統(tǒng)都無法避開一個問題:脫靶效應(yīng)[32-33].由于II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性取決于PAM前20 bp的sgRNA,理論上脫靶效率會很高,目前很多實驗證實CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效率低于ZFN和TALEN,特異性很高.但針對不同生物、不同組織、不同細(xì)胞CRISPR/Cas系統(tǒng)作用效率還有差別.CRISPR/Cas系統(tǒng)還面臨另一個問題——很多器官組織及原代細(xì)胞難轉(zhuǎn)染,張鋒課題組構(gòu)建出了慢病毒CRISPR/Cas9,可以高效轉(zhuǎn)染組織和細(xì)胞[34].在原核注射方面,sgRNA和Cas9 RNA的濃度越高,作用效率越高,但是理論上來說可能會給胚胎帶來高毒性; Wang等研究表明,高濃度的RNA給胚胎帶來的毒性很低[19].因此,需要研究者繼續(xù)優(yōu)化以開發(fā)出低脫靶、高效率的CRISPR/Cas系統(tǒng).

    4展望

    CRISPR/Cas系統(tǒng)對生命科學(xué)的發(fā)展起著革命性的作用,極大地拓展了研究者對模式生物的研究能力,同時也為探索治愈遺傳性疾病提供了一條路徑.該系統(tǒng)在基因改造方面具有極強(qiáng)的潛力和靈活性,但是,PAM序列的存在限制了II型CRISPR/cas系統(tǒng)的應(yīng)用.如何對 II型CRISPR/Cas系統(tǒng)Cas9蛋白改造最終摒棄PAM序列,以拓展其應(yīng)用范圍?目前,研究者在研究強(qiáng)烈火球菌和硫磺礦硫化葉菌時發(fā)現(xiàn)Cas RAMP模塊(Cmr)系統(tǒng),由蛋白質(zhì)和30~40 nt堿基組成,修飾對象為RNA;該系統(tǒng)具有高效率、低脫靶[35-36]特點.該技術(shù)還主要集中在對原核生物的研究,相信不久將來,將會應(yīng)用到哺乳類等真核生物.可以預(yù)見,CRISPR/Cas系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究、疾病治療以及育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景,將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義.

    參考文獻(xiàn):

    [1] Jon W G, George A S, Diane J P,etal. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA[J]. PNAS,1980,7(12):7380-7384.

    [2] Breakthrough of the Year. The runners-up[J]. Science,2012,338(6114):1525-1532.

    [3] Plump A S, Smith J D, Hayek T,etal. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells[J]. Cell,1992,71(2):343-353.

    [4] Yang D S, Zhang J F, Xu J,etal. Production of apolipoprotein C-III knockout rabbits using zinc finger nucleases[J]. J Vis Exp,2013,81:e50957.

    [5] Luo J J, Song Z Y, Yu S L,etal. Efficient generation of myostatin (MSTN) biallelic mutations in cattle using zinc finger nucleases[J]. PLoS One,2014,9(4):e95225.

    [6] Wilson K A, Chateau M L, Porteus M H. Design and development of artificial zinc finger transcription factors and zinc finger nucleases to thehTERTLocus[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids,2013,2(4):e87.

    [7] Xavier M A, Rajiv S, Yannick D,etal. Robust ZFN-mediated genome editing in adult hemophilic mice[J]. Blood,2013,122(19):3283-3287.

    [8] Soldner F, Laganière J, Cheng A W,etal. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations[J]. Cell,2011,146(2):318-331.

    [9] H?her T, Wallace L, Khan K,etal. Highly efficient zinc-finger nuclease-mediated disruption of an eGFP transgene in keratinocyte stem cells without impairment of stem cell properties[J]. Stem Cell Rev,2011,8(2):426-434.

    [10] Cheng Z, Yi P S, Wang X M,etal. Conditional targeted genome editing using somatically expressed TALENs inC.elegans[J]. Nature Biotechnology,2013,31(10):934-937.

    [11] Ma S Y, Zhang S L, Wang F,etal. Highly efficient and specific genome editing in silkworm using custom TALENs[J]. PLoS One,2012,7(9):e45035.

    [12] Liu H L, Chen Y C, Niu Y Y,etal. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys[J]. Cell Stem Cell,2014,14(3):323-328.

    [13] Takada S, Sato T, Ito Y,etal. Targeted gene deletion of miRNAs in mice by TALEN system[J]. PLoS One,2013,8(10):e76004.

    [14] Takefumi K, Tetsushi S, Housei W,etal. TALEN-induced gene knock out inDrosophila[J]. Develop Growth Differ,2014,56(1):86-91.

    [15] Zu Y, Tong X J, Wang Z X,etal. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish[J]. Nature Methods,2013,10(4):329-331.

    [16] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K,etal. Nucleotide sequence of theiapgene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli, and identification of the gene product[J]. J Bacteriol,1987,169(12):5429-5433.

    [17] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J]. BMC Bioinformatics,2007,8(1):172.

    [18] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M,etal. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNaseIII[J]. Nature,2011,471(7340):602-607.

    [19] Wang H Y, Yang H, Shivalila C S,etal. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell,2013,154(6):1370-1379.

    [20] Chang N N, Sun C H, Gao L,etal. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos[J]. Cell Res,2013,23(4):465-472.

    [21] Mali P, Yang L H, Esvelt K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science,2013,339(6121):823-826.

    [22] Friedland A E, Tzur Y B, Esvelt K M,etal. Heritable genome editing inC.elegansvia a CRISPR-Cas9 system[J].Nat Methods,2013,10(8):741-743.

    [23] Li D L, Qiu Z W, Shao Y J,etal. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system[J]. Nat Biotechnology,2013,31(8):681-683.

    [24] Niu Y Y, Shen B, Cui Y Q,etal. Generation of gene-modifiedcynomolgusmonkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J]. Cell,2014,156(4):836-843.

    [25] Shan Q W, Wang Y P, Li J,etal. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology,2013,31(8):686-688.

    [26] Lei S Q, Matthew H L, Luke A G,etal. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided platform for sequence specific control of gene expression[J]. Cell,2013,152(5):1173-1183.

    [27] Gilbert L A, Larson M H, Morsut L,etal. CRISPR-Mediated modular RNA-Guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell,2013,154(2):442-451.

    [28] Urnov F D, Miller J C, Lee Y L,etal. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases[J]. Nature,2005,435(7042):646-651.

    [29] Wu Y X, Liang D,Wang Y H,etal. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9[J]. Cell Stem Cell,2013,13(6):659-662.

    [30] Schwank G, Koo B K, Sasselli V,etal. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients[J]. Cell Stem Cell,2013,13(6):653-658.

    [31] Ebina H, Misawa N, Kanemura Y,etal. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latentHIV-1 provirus[J]. Sci Rep,2013(3):2510.doi:10.1038/srep02510.

    [32] Kuscu C, Arslan S, Singh R,etal. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nat Biotechnology,2014,32(7):677-683.

    [33] Lin Y N, Cradick T J, Brown M T,etal. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences[J].Nucleic Acids Res,2014,42(11):7473-7485.

    [34] Yin H, Xue W, Chen S D,etal. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype[J]. Nat Biotechnology,2014,32:551-553.

    [35] Hale C R, Zhao P, Olson S,etal. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPRRNA-Cas protein complex[J]. Cell,2009,139(5):945-956.

    [36] Hale C R., Majumdar S, Elmore J,etal. Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs[J]. Mol Cell,2012,45(3):292-302.

    Genome Editing Techniques—CRISPR/Cas System

    CHEN Yonglong1, HUANG Huarong1, TANG Pingping2, YANG Xueqin1, LI Feixue1, XU Jie1, ZHANG Zunyi1

    (1.Institute of Developmental and Regenerative Biology, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China;

    2.Shimen Central Hospital, Jiaxing 314512, China)

    Abstract:Genome editing technologies include gene targeting based on embryonic stem cells and homologous gene fragments recombination, zinc-finger nucleases(ZFN), transcription activator-like effectors nuclease(TALEN) and CRISPR/Cas system. CRISPR/Cas system has merits of operating simply, high mutation rate with low-cost and editing multiple genes simultaneously. It can fixed-point modify, such as knockout, insert and replace genes. This system has successfully applied to a variety of organisms such as mouse, human cells, nematode, fruit fly, zebra fish, arabidopsis, rice and monkey. The paper outlines the development of gene modificative technology, and illustrates the principle, application as well as the merits and demerits of CRISPR/Cas system.

    Key words:genomic modification; CRISPR/cas system; genome editing

    第14卷第1期2015年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.14No.1Jan.2015

    文章編號:1674-232X(2015)01-0060-06

    中圖分類號:Q33;Q78

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.01.011

    通信作者:張遵義(1957—),男,教授,博士,主要從事動物頭面部器官發(fā)育及新生缺陷形成中的遺傳學(xué)機(jī)理研究.E-mail:zunyizhang@idrbio.org

    基金項目:浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2014R421071);杭州師范大學(xué)大學(xué)生科研項目(1283XXM141);浙江省科技計劃項目(2013C37024);杭州師范大學(xué)2014研究生創(chuàng)新基金項目.

    收稿日期:2014-07-31

    猜你喜歡
    基因編輯基因修飾
    器官異種移植展現(xiàn)長期存活率
    從基因編輯看歐美對新型基因修飾生物技術(shù)的監(jiān)管及挑戰(zhàn)
    Nurr1基因修飾胚胎中腦神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病
    CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展
    今日健康(2016年11期)2017-06-09 03:02:11
    基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
    科技視界(2017年2期)2017-04-18 18:52:33
    CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯中的應(yīng)用研究進(jìn)展
    血管生成素-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦梗死大鼠行為學(xué)的影響
    亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 两个人的视频大全免费| 亚洲专区中文字幕在线| 国产成年人精品一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久亚洲精品不卡| 精品久久久久久久末码| 又爽又黄a免费视频| 激情在线观看视频在线高清| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 直男gayav资源| 国内精品一区二区在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美成人a在线观看| 欧美3d第一页| 欧美乱色亚洲激情| 精品人妻视频免费看| 露出奶头的视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线a可以看的网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜激情欧美在线| 天堂网av新在线| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜a级毛片| 嫩草影院精品99| 一进一出抽搐动态| 在线播放无遮挡| 久久热精品热| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 久久久久久久午夜电影| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久成人av| 激情在线观看视频在线高清| 我的女老师完整版在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲在线自拍视频| 国产免费一级a男人的天堂| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 九色成人免费人妻av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲专区国产一区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 51国产日韩欧美| 免费人成在线观看视频色| 国产免费一级a男人的天堂| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精华一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 99视频精品全部免费 在线| 丰满的人妻完整版| 天天躁日日操中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 小说图片视频综合网站| 波多野结衣高清作品| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲av成人精品一区久久| 全区人妻精品视频| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲成av人片免费观看| 成人精品一区二区免费| 国产三级在线视频| 夜夜爽天天搞| 日韩欧美在线二视频| 激情在线观看视频在线高清| 99热只有精品国产| 久久久国产成人免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 中文资源天堂在线| 深夜a级毛片| 床上黄色一级片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av国产免费在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av美国av| 一级黄片播放器| 9191精品国产免费久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 男女之事视频高清在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日本成人三级电影网站| 免费av毛片视频| 国产亚洲精品久久久com| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产高潮美女av| 亚洲熟妇熟女久久| 久久草成人影院| 亚洲av二区三区四区| 亚洲综合色惰| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产av麻豆久久久久久久| 此物有八面人人有两片| 欧美激情在线99| 亚洲第一电影网av| av福利片在线观看| 综合色av麻豆| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲性夜色夜夜综合| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 免费看a级黄色片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利免费观看在线| 99热这里只有精品一区| av在线蜜桃| 色综合站精品国产| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产91精品成人一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日本五十路高清| 一夜夜www| 人妻久久中文字幕网| netflix在线观看网站| 国产野战对白在线观看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲美女黄片视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲第一电影网av| 免费在线观看影片大全网站| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 哪里可以看免费的av片| 国产成人av教育| 欧美乱色亚洲激情| 男人舔女人下体高潮全视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 此物有八面人人有两片| 国产高清有码在线观看视频| 日本三级黄在线观看| 熟女电影av网| 综合色av麻豆| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| a级一级毛片免费在线观看| av在线观看视频网站免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩人妻高清精品专区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一级黄片播放器| 美女黄网站色视频| 久久久久性生活片| 久久国产精品影院| 国产一区二区激情短视频| 欧美黄色淫秽网站| 国产午夜精品论理片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 俺也久久电影网| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产色爽女视频免费观看| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久国产精品人妻蜜桃| 色在线成人网| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 深夜精品福利| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 成年女人永久免费观看视频| 日本在线视频免费播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| а√天堂www在线а√下载| 日韩欧美在线二视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av不卡在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲18禁久久av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品在线美女| 99久久无色码亚洲精品果冻| 中文字幕av在线有码专区| 精品人妻视频免费看| 性色avwww在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产高清激情床上av| 可以在线观看的亚洲视频| 99国产精品一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久久久久九九精品二区国产| 一夜夜www| 国产色婷婷99| 精品久久久久久久久亚洲 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜a级毛片| 成人av在线播放网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 又爽又黄a免费视频| 国产av在哪里看| 97热精品久久久久久| 中文资源天堂在线| 精品久久国产蜜桃| 亚洲不卡免费看| 日韩人妻高清精品专区| 成年人黄色毛片网站| 一本综合久久免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99国产精品一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 天堂影院成人在线观看| 欧美在线黄色| 99久久精品国产亚洲精品| 国产老妇女一区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久成人免费电影| 午夜激情福利司机影院| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一级毛片久久久久久久久女| 在线国产一区二区在线| 天堂√8在线中文| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美清纯卡通| 婷婷亚洲欧美| av在线天堂中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 五月伊人婷婷丁香| xxxwww97欧美| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲国产精品999在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 12—13女人毛片做爰片一| 一个人观看的视频www高清免费观看| 看片在线看免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久99热6这里只有精品| 欧美三级亚洲精品| 日韩高清综合在线| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av电影在线进入| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 免费人成在线观看视频色| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一级黄片播放器| 欧美日韩黄片免| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日韩欧美在线乱码| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产在视频线在精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美3d第一页| 亚洲精品一区av在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产乱人伦免费视频| 乱人视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 有码 亚洲区| 直男gayav资源| 精品人妻视频免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国产亚洲在线| www.www免费av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 我要看日韩黄色一级片| 成人精品一区二区免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费观看精品视频网站| 亚洲av免费在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久性生活片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜精品在线福利| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本 欧美在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 听说在线观看完整版免费高清| 国产色婷婷99| 欧美黄色片欧美黄色片| 乱码一卡2卡4卡精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本黄色片子视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 小说图片视频综合网站| 在线观看午夜福利视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久亚洲真实| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费在线观看成人毛片| 中文字幕免费在线视频6| 成人特级av手机在线观看| 久久久国产成人免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中文字幕熟女人妻在线| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 香蕉av资源在线| 日韩有码中文字幕| 日本熟妇午夜| 国产精品,欧美在线| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品99久久久久久久久| www.色视频.com| 亚洲成人久久爱视频| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美三级亚洲精品| 久久九九热精品免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 91久久精品国产一区二区成人| 99国产精品一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| a级一级毛片免费在线观看| 欧美精品国产亚洲| 亚洲三级黄色毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 怎么达到女性高潮| 国产精品三级大全| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av电影在线进入| 中文字幕高清在线视频| av在线天堂中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美日本视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美不卡视频在线免费观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 免费人成视频x8x8入口观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久色成人| 亚洲 国产 在线| 能在线免费观看的黄片| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女 人体艺术 gogo| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产男靠女视频免费网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜福利在线在线| 欧美黄色淫秽网站| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲avbb在线观看| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久久久久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 色尼玛亚洲综合影院| 国产高清激情床上av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品av视频在线免费观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 丰满的人妻完整版| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲自偷自拍三级| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲午夜理论影院| 亚洲七黄色美女视频| 成人一区二区视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 婷婷精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 免费大片18禁| 中文字幕免费在线视频6| 国产免费一级a男人的天堂| 丝袜美腿在线中文| 真人做人爱边吃奶动态| 一进一出好大好爽视频| 国产成人欧美在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线播放无遮挡| 变态另类丝袜制服| 天堂影院成人在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久国产精品影院| 天美传媒精品一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 九色国产91popny在线| 长腿黑丝高跟| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久久久久九九精品二区国产| 99热6这里只有精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人欧美在线观看| 久久99热这里只有精品18| 精品日产1卡2卡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美zozozo另类| 免费av不卡在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看av片永久免费下载| 免费看日本二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产成人aa在线观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲美女搞黄在线观看 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美精品国产亚洲| 91狼人影院| 91久久精品国产一区二区成人| 九九在线视频观看精品| 成人性生交大片免费视频hd| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜福利成人在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品伦人一区二区| 色吧在线观看| 久久久久久久久中文| 两个人视频免费观看高清| 99视频精品全部免费 在线| 国产真实乱freesex| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人啪精品午夜网站| 男女床上黄色一级片免费看| 人人妻人人看人人澡| av视频在线观看入口| 亚洲专区中文字幕在线| 免费看日本二区| 一进一出好大好爽视频| 午夜视频国产福利| 欧美激情在线99| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 在线看三级毛片| 日本 av在线| 怎么达到女性高潮| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 毛片女人毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| www.999成人在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩欧美三级三区| 中文资源天堂在线| 最后的刺客免费高清国语| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费看日本二区| 美女黄网站色视频| 国产亚洲精品av在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 久久草成人影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产午夜精品论理片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 97碰自拍视频| 久久伊人香网站| 国产一区二区激情短视频| 国内精品一区二区在线观看| 最近在线观看免费完整版| 亚洲乱码一区二区免费版| av黄色大香蕉| or卡值多少钱| 国产老妇女一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲片人在线观看| 九色国产91popny在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 小说图片视频综合网站| 很黄的视频免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 成人特级黄色片久久久久久久| xxxwww97欧美| 精品乱码久久久久久99久播| 国产亚洲精品av在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜免费成人在线视频| 级片在线观看| 欧美性感艳星| 熟女电影av网| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲av免费在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 俺也久久电影网| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文在线观看免费www的网站| 午夜福利免费观看在线| 麻豆成人av在线观看| 久久久久性生活片| 国产精品,欧美在线| 色5月婷婷丁香| 午夜福利视频1000在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久国产乱子免费精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美zozozo另类| 在线观看av片永久免费下载| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| a级毛片a级免费在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 成人av一区二区三区在线看| 中文字幕免费在线视频6| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费无遮挡裸体视频| 51国产日韩欧美| www.色视频.com| 中文资源天堂在线| 亚洲成av人片免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产色婷婷99| 亚洲黑人精品在线| 此物有八面人人有两片| 国产综合懂色| 超碰av人人做人人爽久久| 日本黄大片高清| 免费看日本二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| av福利片在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 亚洲最大成人中文| 可以在线观看的亚洲视频| 精品一区二区免费观看| 欧美高清成人免费视频www| 午夜免费激情av| 搡老岳熟女国产| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产三级在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99国产极品粉嫩在线观看| 男女那种视频在线观看| av视频在线观看入口| 嫩草影视91久久| 真实男女啪啪啪动态图| 性色av乱码一区二区三区2| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品女同一区二区软件 | 久久精品综合一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 成年版毛片免费区| 99久久精品国产亚洲精品| 波多野结衣高清作品| 一个人看的www免费观看视频| 两人在一起打扑克的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄色日韩在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 长腿黑丝高跟| 在线观看66精品国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 麻豆国产97在线/欧美| .国产精品久久| 欧美中文日本在线观看视频| 国产三级黄色录像| 全区人妻精品视频| 成人亚洲精品av一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品一区二区三区人妻视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日本免费a在线| 成人国产一区最新在线观看| 99热这里只有是精品50|