Klotho基因多態(tài)性在海南黎、漢族冠心病人群中的表達(dá)特征研究

周君霞

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·論著·

Klotho基因多態(tài)性在海南黎、漢族冠心病人群中的表達(dá)特征研究

周君霞

目的 探討Klotho基因多態(tài)性在海南黎、漢族冠心病人群中的表達(dá)特征。方法 選取2013年1月—2014年12月在?？谑腥嗣襻t(yī)院心內(nèi)科住院的黎族冠心病患者48例和漢族冠心病患者52例為冠心病組，及同期在該院體檢中心進(jìn)行體檢的黎族健康人群50例和漢族健康人群50例為對照組，記錄各組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及血壓、血脂、血糖水平，檢測Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性和Klotho蛋白水平。結(jié)果 黎族、漢族冠心病組BMI、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與各自對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黎族冠心病組與對照組GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；漢族冠心病組與對照組GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黎族冠心病組與對照組GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；漢族冠心病組與對照組GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 在漢族冠心病人群中，Klotho基因多態(tài)性和蛋白表達(dá)水平與冠心病有關(guān)，G395A位點(diǎn)AA基因型易患冠心病，GG基因型可能對冠心病有保護(hù)作用。在黎族冠心病人群中，Klotho基因多態(tài)性和蛋白表達(dá)水平與冠心病無明顯關(guān)系。

Klotho基因；冠心??；黎族；漢族；表達(dá)特征

周君霞.Klotho基因多態(tài)性在海南黎、漢族冠心病人群中的表達(dá)特征研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(25)：3065-3068.[www.chinagp.net]

Zhou JX.Expression features of Klotho gene polymorphism among Li and Han people with coronary heart diseases in Hainan Province[J].Chinese General Practice，2015，18(25)：3065-3068.

Klotho基因是1997年新發(fā)現(xiàn)的一種與人類衰老密切相關(guān)的基因，主要在腎臟和腦脈絡(luò)膜中表達(dá)，推測可能與高血壓、動脈硬化、腎功能減退等衰老性疾病有關(guān)[1-2]。國外針對不同種族人群的多項(xiàng)研究顯示，Klotho基因中包括F352V和C370S等多個位點(diǎn)突變，改變Klotho蛋白的功能，與冠心病密切相關(guān)[3-4]。國內(nèi)一項(xiàng)針對漢族人群的研究顯示，Klotho基因中G395A、F352V多態(tài)分布與高血壓、高血脂等密切相關(guān)[5]。目前關(guān)于Klotho基因在我國冠心病人群中表達(dá)特征的研究較少。故本研究對海南黎族、漢族冠心病患者中Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測，旨在揭示Klotho基因的表達(dá)特征，為冠心病的診治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年1月—2014年12月在海口市人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的黎族冠心病患者48例和漢族冠心病患者52例為冠心病組，受試者均經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)存在1支及以上冠狀動脈狹窄≥50%。另選取同期在該院體檢中心進(jìn)行體檢的黎族健康人群50例和漢族健康人群50例為對照組，均無心悸、胸悶、胸痛等冠心病臨床表現(xiàn)，心電圖、超聲心動圖等檢查顯示無缺血性心臟病改變。黎(漢)族判斷標(biāo)準(zhǔn)為：祖籍為黎(漢)族且三代以內(nèi)父母均為黎(漢)族。本研究經(jīng)過該院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 資料收集 記錄所有受試者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，使用全自動生化分析儀(日立-7600)測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)等指標(biāo)。

1.3 Klotho基因多態(tài)性檢測

1.3.1 DNA提取 取外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝，使用人血液基因組DNA抽提試劑盒(大連寶生工程有限公司)操作，方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 等位基因特異引物-聚合酶鏈反應(yīng)(ASP-PCR) 使用等位基因ASP-PCR技術(shù)檢測Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性。引物序列設(shè)計參照美國國家生物信息中心基因庫，使用Primer 5.0 Input軟件自行設(shè)計G395A位點(diǎn)PCR引物序列。Klotho基因G395A上游引物：5-AATCGGCTCCAGCAAT GTCCAG-3′；下游引物：G等位基因5′-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTC-3′，A等位基因5′-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTT-3′(上下游引物由大連寶生工程有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系采用20 μl標(biāo)準(zhǔn)：10×buffer 2 μl，上、下游引物各1.6 μl，耐熱DNA(TapDNA)聚合酶0.1 μl，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1.6 μl，脫氧核糖核酸(DNA)0.3 μl，氯化鎂(MgCl2) 1.6 μl，滅菌雙蒸水(ddH20)11.2 μl。反應(yīng)條件為：G等位基因94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延長10 min；A等位基因除退火30 s采用61 ℃外，其余均與G等位基因相同。取PCR產(chǎn)物6 μl加入2%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)觀測PCR擴(kuò)增效果。G395A位點(diǎn)多態(tài)性等位基因型為GG、GA、AA，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為147 bp。

1.4 Klotho蛋白水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定Klotho蛋白水平，嚴(yán)格按照Klotho蛋白試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)說明書操作，至少測3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 黎族、漢族冠心病組與對照組一般資料比較 黎族冠心病組中男34例，女14例；對照組中男32例，女18例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.520，P>0.05)。漢族冠心病組中男36例，女16例；對照組中男32例，女18例，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.313，P>0.05)。黎族冠心病組與對照組年齡、TG、HDL-C、FPG間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而BMI、SBP、DBP、TC、LDL-C間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；漢族冠心病組與對照組年齡、TG、HDL-C間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而BMI、SBP、DBP、TC、LDL-C、FPG間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；黎族冠心病組與漢族冠心病組FPG間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其余指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 黎族、漢族冠心病組與對照組Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性比較 黎族冠心病組與對照組GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；漢族冠心病組與對照組GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；黎族冠心病組與漢族冠心病組GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 黎族、漢族冠心病組與對照組Klotho蛋白水平比較 黎族冠心病組與對照組GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；漢族冠心病組與對照組GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；黎族冠心病組與漢族冠心病組GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表1 黎族、漢族冠心病組與對照組一般資料比較±s)

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，F(xiàn)PG=空腹血糖；1 mm Hg=0.133 kPa；與漢族冠心病組比較，aP<0.05

表2 黎族、漢族冠心病組與對照組Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性比較

Table 2 Comparison of Klotho gene polymorphism of G395A between CHD group and control group in Li people and Han people

組別例數(shù)基因型〔n(%)〕GG GA AA等位基因〔%(n/N)〕G A黎族 對照組5028(56.0)16(32.0)6(12.0)72.0(72/100)28.0(28/100) 冠心病組4825(52.1)a16(33.3)a7(14.6)a68.8(66/96)a31.2(30/96)a χ2值0.2060.248 P值>0.05>0.05漢族 對照組5029(58.0)17(34.0)4(8.0)75.0(75/100)25.0(25/100) 冠心病組5214(26.9)23(44.3)15(28.8)49.0(51/104)51.0(53/104) χ2值12.46614.549 P值<0.05<0.05

注：與漢族冠心病組比較，aP<0.05

Table 3 Comparison of Klotho protein level between CHD group and control group in Li people and Han people

組別例數(shù)GGGAAA黎族 對照組5012.9±1.411.5±1.88.1±1.6 冠心病組4812.7±2.2a11.6±2.3a8.3±1.4a t值0.5340.2400.657 P值>0.05>0.05>0.05漢族 對照組5013.2±1.511.3±2.17.9±1.3 冠心病組5211.9±1.99.4±1.36.1±1.5 t值3.8265.4696.466 P值<0.05<0.05<0.05

注：與漢族冠心病組比較，aP<0.05

3 討論

Klotho蛋白具有廣泛的生理功能，如維持細(xì)胞膜的完整性、增加血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-1的活性、增加唾液酸酶活性、維持肺的結(jié)構(gòu)功能、保護(hù)心血管系統(tǒng)等，并隨著年齡增長其表達(dá)逐漸降低[6]。國外研究證實(shí)歐洲人群中Klotho-VS突變純合子是其早發(fā)隱匿性冠心病的獨(dú)立危險因素；Klotho-VS與SBP和HDL-C有明確相關(guān)性，純合子基因型攜帶者較雜合子心血管病危險性高，而以突變純合子基因型攜帶者危險度最高[7]。Jo等[8]發(fā)現(xiàn)在韓國人群Klotho基因G395A位點(diǎn)突變與冠狀動脈狹窄呈正相關(guān)；而國內(nèi)在重慶漢族人群中的研究卻發(fā)現(xiàn)Klotho基因G395A位點(diǎn)突變與其動脈硬化呈負(fù)相關(guān)[9]。這兩種相反結(jié)果表明Klotho基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系可能存在較大的種族差異。故本研究對海南黎族和漢族冠心病人群中Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行比較。

黎族是海南島特有的原住民族，與外界交流較少，有特殊的遺傳背景和海島生活方式。國內(nèi)針對黎族人群的一些心血管病研究已經(jīng)證實(shí)黎族和漢族在某些基因位點(diǎn)上存在差異[10]。本研究選取黎族人群的標(biāo)準(zhǔn)是三代以內(nèi)父母均為黎族，保證了研究人群的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性可能與漢族人群冠心病密切相關(guān)，漢族人群G395A位點(diǎn)的AA基因型易患冠心病，GG基因型可能對冠心病有保護(hù)作用；Klotho蛋白水平在冠心病組中明顯降低，提示該基因可能有冠心病保護(hù)作用，這與有關(guān)文獻(xiàn)類似[11]。但是在黎族人群中，并未發(fā)現(xiàn)Klotho基因G395A中的GG、GA、AA位點(diǎn)和冠心病有關(guān)，僅發(fā)現(xiàn)黎族人群Klotho基因GG蛋白表達(dá)水平高于GA和AA，但這種趨勢在黎族冠心病人群和健康對照人群中均存在。本研究還發(fā)現(xiàn)，黎族冠心病組比漢族冠心病組GG基因頻率和G等位基因頻率明顯升高，GA、AA基因頻率和A等位基因頻率明顯降低，GG、GA、AA蛋白表達(dá)水平均明顯升高，進(jìn)一步說明 Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性對黎族冠心病人群影響作用不明顯。

綜上所述，在海南漢族人群中，Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病密切相關(guān)，但在海南黎族人群中，G395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病無明顯關(guān)系，這可能與種族遺傳差異有關(guān)，是否存在其他機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：崔沙沙)

Expression Features of Klotho Gene Polymorphism Among Li and Han People With Coronary Heart Diseases in Hainan Province

ZHOUJun-xia.

DepartmentofCentralLaboratory,HaikouMunicipalPeople′sHospital,Haikou570208,China

Objective To explore the expression features of Klotho gene polymorphism among Li and Han people with coronary heart diseases(CHD).Methods We enrolled 48 Li people with CHD and 52 Han people with CHD who were admitted into the Department of Cardiology of Haikou Municipal People′s Hospital from January 2013 to December 2014 as CHD group.We also enrolled 50 healthy Li people and 50 healthy Han people who received physical examination in the hospital in the same period as control group.Gender,age,body mass index(BMI) and blood pressure,blood lipid and blood glucose level were recorded,and Klotho gene polymorphism of G395A and Klotho protein level were examined.Results There were significant differences between CHD group and control group in Li people and Han people in BMI,systolic blood pressure(SBP)，diastolic blood pressure(DBP),total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C).There were no significant differences in the distribution of GG,GA,AA genotypes and G,A alleles between CHD group and control group in Li people(P>0.05);there were significant differences in the distribution of GG,GA,AA genotypes and G,A alleles between CHD group and control group in Han people(P<0.05).There were no significant differences in the protein expression level of GG,GA,AA between CHD group and control group in Li people(P>0.05);there were significant differences in the protein expression level of GG,GA,AA between CHD group and control group in Han people(P<0.05).Conclusion Among Han people with CHD,the polymorphism and protein expression level of Klotho gene are correlated with coronary diseases，AA of G395A is liable to CHD,and GG may have a protective effect from CHD.Among Li people with CHD,there is no remarkable correlation between the polymorphism and protein expression level of Klotho gene and CHD.

Klotho gene;Coronary disease;Li nationality;Han nationality;Expression features

570208海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

R 541.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.25.015

2015-05-21；

2015-07-15)