神經(jīng)肽S受體1基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性的研究*

神經(jīng)肽S受體1基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性的研究*

劉適#王曉兵周峰吳婷周瑞劉靜夏冰&

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科(430071)

*基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域)(20130141130007)

#Email: sancyliu198652@sina.com

背景：研究表明神經(jīng)肽S受體1(NPSR1)基因多態(tài)性與歐洲人群炎癥性腸病(IBD)的遺傳易感性相關(guān)，但尚無研究探討兩者在中國人群中的相關(guān)性。目的：探討中國漢族人群中NPSR1基因多態(tài)性與IBD的關(guān)系。方法：收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院457例確診IBD患者[潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組355例，克羅恩病(CD)組102例]和500名健康對照者，以PCR和測序技術(shù)分析NPSR1基因rs323922(C→G突變)、rs740347(G→C突變)位點(diǎn)多態(tài)性。結(jié)果：UC組與對照組間、CD組與對照組間rs323922、rs740347位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；蛐团cIBD臨床表型的相關(guān)性分析顯示：①rs323922位點(diǎn)突變型CG基因型與男性CD(OR: 0.441, 95% CI: 0.230~0.844)和結(jié)腸型CD(OR: 0.425, 95% CI: 0.199~0.911)相關(guān)，為保護(hù)因素。②rs740347位點(diǎn)突變型CC基因型與CD早期發(fā)病(<16歲)相關(guān)(OR: 15.019, 95% CI: 2.634~86.470)，突變型C等位基因與結(jié)腸型CD相關(guān)(OR: 2.142, 95% CI: 1.709~4.294)，兩者均為危險(xiǎn)因素。結(jié)論：NPSR1基因rs323922、rs740347位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群的IBD遺傳易感性無關(guān)，但與IBD的某些臨床表型有關(guān)。

關(guān)鍵詞炎癥性腸??；神經(jīng)肽S受體1；多態(tài)性，單核苷酸；疾病遺傳易感性；中國

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，目前觀點(diǎn)認(rèn)為遺傳易感性為IBD致病因素之一[1-2]。21世紀(jì)初，Laitinen等[3-4]通過對芬蘭一個(gè)奠基者種群行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)染色體7p14-p15區(qū)域存在與哮喘和高血清IgE相關(guān)的易感位點(diǎn)，鑒定顯示該基因編碼一孤兒G蛋白耦聯(lián)受體[哮喘易感性G蛋白耦聯(lián)受體(GPRA)]，即神經(jīng)肽S受體1(neuropeptide S receptor 1, NPSR1)。之后國內(nèi)外多項(xiàng)遺傳學(xué)研究顯示NPSR1基因多態(tài)性與免疫相關(guān)疾病，如支氣管哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的遺傳易感性有關(guān)[4-10]，對意大利、瑞典、芬蘭等歐洲人群的研究表明NPSR1基因多態(tài)性與IBD遺傳易感性亦有關(guān)聯(lián)[11-12]，但尚無研究探討兩者在中國人群中的相關(guān)性。本研究通過分析中國漢族人群的NPSR1基因多態(tài)性分布情況，旨在明確該基因多態(tài)性與中國漢族人群IBD的關(guān)系，為闡明IBD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

一、一般資料

收集2009年1月-2012年9月在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就診的IBD患者457例，UC組355例，男189例，女166例，平均發(fā)病年齡(39.8±15.3)歲；CD組102例，男61例，女41例，平均發(fā)病年齡(30.5±13.5)歲。入組患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)、內(nèi)鏡和組織學(xué)檢查綜合診斷，符合“對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(2007年,濟(jì)南)”[13]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集同期于中南醫(yī)院行健康體檢并排除IBD以及其他免疫相關(guān)疾病和家族史的健康人500名作為對照組，其中男281名，女219名，平均年齡(41.9±12.9)歲。病例組和對照組所有個(gè)體均為漢族。UC組與CD組發(fā)病年齡差異顯著，與流行病學(xué)調(diào)查中兩者發(fā)病年齡高峰的整體趨勢相一致[14]。

二、標(biāo)本采集

受檢者采集靜脈血5 mL，EDTA抗凝，以血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取全基因組DNA。

三、基因多態(tài)性分析

本研究針對rs323922(C→G突變)、rs740347(G→C突變)兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1. PCR擴(kuò)增目的片段：以Primer Premier 5.0軟件 設(shè)計(jì)rs323922、rs740347位點(diǎn)的PCR引物。rs323922: F 5’-TCC ACC ATC TTG CCT GTG AG-3’，R 5’-CAG GAC CAA GTT GTG GTA GCT GTA TT-3’；rs740347：F 5’-ACA ATA ATG AAG ACT CAA TTT CAG C-3’，R 5’-AGC AGG CAA GAA GAG GAG T-3’。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；終末72 ℃ 10 min。

2. 測序：由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，Chromas基因測序峰圖查看軟件分析結(jié)果，并錄入Excel軟件。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間基因型頻率和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，并計(jì)算OR值及其95% CI，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

結(jié)果

一、遺傳平衡

對病例組和對照組rs323922、rs740347位點(diǎn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，P值均大于0.05，表明各基因型頻率達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

二、基因型和等位基因頻率

UC組與對照組間、CD組與對照組間rs323922、rs740347位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、表2)。

三、基因型與IBD臨床表型的相關(guān)性

分別對UC組、CD組rs323922、rs740347位點(diǎn)基因型與性別、發(fā)病年齡、病變部位、并發(fā)癥(如狹窄、穿孔、肛周病變等)等臨床參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論。其余納入分析的臨床參數(shù)與所檢測位點(diǎn)基因型無相關(guān)性。

①在男性CD患者中，rs323922位點(diǎn)突變型CG基因型頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義，CG突變?yōu)槟行訡D的保護(hù)因素(表3)。

②在病變累及結(jié)腸的CD患者中，rs323922位點(diǎn)突變型CG基因型頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CG突變?yōu)榻Y(jié)腸型CD的保護(hù)因素(表3)。

③在早期發(fā)病(<16歲)CD患者中，rs740347位點(diǎn)突變型CC基因型頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義，CC突變?yōu)镃D早期發(fā)病的危險(xiǎn)因素(表4)。

④在病變累及結(jié)腸的CD患者中，rs740347位點(diǎn)突變型C等位基因頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C等位基因?yàn)榻Y(jié)腸型CD的危險(xiǎn)因素(表4)。

表1　UC組與對照組間rs323922、rs740347位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 n(%)

表2　CD組與對照組間rs323922、rs740347位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 n(%)

表3　CD患者rs323922位點(diǎn)基因型與臨床表型相關(guān)性分析

表4　CD患者rs740347位點(diǎn)基因型與臨床表型相關(guān)性分析

討論

神經(jīng)肽S(neuropeptide S, NPS)是一種20氨基小肽，因氨基端殘基均為絲氨酸(S)而得名，通過與其受體NPSR1結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)睡眠和覺醒、抗焦慮、減少驚恐發(fā)作、影響攝食行為、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和傷害性感受等作用[15-17]。NPSR1又名GPRA、血管加壓素受體相關(guān)受體-1(VRR1)或GPR154，是一種七次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體，NPSR1-A和NPSR1-B為其最重要的2個(gè)亞型[11,18-19]。研究表明NPSR1廣泛分布于人體呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、上皮組織以及肝、脾、淋巴結(jié)等免疫器官，外周血單核細(xì)胞表面亦有NPSR1表達(dá)[20]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為NPS-NPSR1信號(hào)與哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IBD等免疫相關(guān)疾病有密切聯(lián)系。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，炎癥狀態(tài)下，食管、胃、小腸、結(jié)腸上皮內(nèi)NPSR1表達(dá)升高，提示其與胃腸道炎癥反應(yīng)有關(guān)[21]；對IBD患者腸組織標(biāo)本的檢測顯示NPSR1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)[11]。NPS-NPSR1信號(hào)可能系通過上調(diào)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)表達(dá)和胞內(nèi)Ca2+濃度，介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與IBD發(fā)病[19]。此外，NPS-NPSR1信號(hào)還可上調(diào)多種胃腸激素表達(dá)，如膽囊收縮素、血管活性腸肽、生長抑素等，引起相應(yīng)臨床癥狀[22-23]。

關(guān)于NPSR1基因多態(tài)性的研究顯示，rs323922、rs740347位點(diǎn)多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及過敏癥狀的發(fā)生相關(guān)[8,24]，鑒于免疫相關(guān)疾病通常具有共同的SNP位點(diǎn)，意大利、瑞典、芬蘭等歐洲國家已開展針對這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與IBD遺傳易感性關(guān)系的研究[11]，但迄今尚無關(guān)于NPSR1基因多態(tài)性與中國人群IBD遺傳易感性關(guān)系的研究報(bào)道。本研究檢測了中國漢族人群的NPSR1基因rs323922、rs740347位點(diǎn)多態(tài)性，盡管歐洲研究發(fā)現(xiàn)rs323922位點(diǎn)與CD顯著相關(guān)[11]，但本研究結(jié)果顯示UC組與對照組間、CD組與對照組間兩位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩者與IBD并無關(guān)聯(lián)。然而，本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)rs323922位點(diǎn)突變型CG基因型與男性CD和結(jié)腸型CD相關(guān)，為兩者的保護(hù)因素；rs740347位點(diǎn)突變型CC基因型與CD早期發(fā)病相關(guān)，突變型C等位基因與結(jié)腸型CD相關(guān)，兩者均為危險(xiǎn)因素。

盡管本研究對入組IBD患者的疾病活動(dòng)度進(jìn)行了評估，但該參數(shù)系隨病情不斷變化，難以按某一標(biāo)準(zhǔn)確定惟一數(shù)值，因此未能對SNP位點(diǎn)與疾病活動(dòng)度的關(guān)系進(jìn)行分析。此外，本研究樣本量和時(shí)間跨度均較大，期間患者使用氨基水楊酸制劑、免疫抑制劑、生物制劑等多種方法進(jìn)行治療，治療方案根據(jù)病情變化隨時(shí)調(diào)整，因此亦未能對SNP位點(diǎn)與藥物療效進(jìn)行相關(guān)性分析。

IBD的遺傳易感性有明顯的種族差異，在東西方人群之間尤為顯著[2]，本研究結(jié)果與針對歐洲人群研究結(jié)果間的差異再次證實(shí)了此種種族差異的存在。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)NPSR1 基因rs323922、rs740347位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群的IBD遺傳易感性之間存在相關(guān)性，但觀察到部分突變與IBD的某些臨床表型有關(guān)，因此尚不能排除NPSR1基因多態(tài)性與中國漢族人群IBD發(fā)病相關(guān)。后續(xù)擬進(jìn)一步探索其他NPSR1基因SNP位點(diǎn)與IBD的關(guān)系，以明確該基因是否為中國漢族人群IBD的易感基因。

參考文獻(xiàn)

1 Uhlig HH, Schwerd T, Koletzko S, et al; COLORS in IBD Study Group and NEOPICS. The diagnostic approach to monogenic very early onset inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2014, 147 (5): 990-1007.e3.

2 Cho JH, Weaver CT. The genetics of inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2007, 133 (4): 1327-1339.

3 Laitinen T, Daly MJ, Rioux JD, et al. A susceptibility locus for asthma-related traits on chromosome 7 revealed by genome-wide scan in a founder population[J]. Nat Genet, 2001, 28 (1): 87-91.

4 Laitinen T, Polvi A, Rydman P, et al. Characterization of a common susceptibility locus for asthma-related traits[J]. Science, 2004, 304 (5668): 300-304.

5 Malerba G, Lindgren CM, Xumerle L, et al. Chromosome 7p linkage and GPR154 gene association in Italian families with allergic asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2007, 37 (1): 83-89.

6 Hersh CP, Raby BA, Soto-Quirós ME, et al. Comprehensive testing of positionally cloned asthma genes in two populations[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007, 176 (9): 849-857.

7 D’Amato M, Zucchelli M, Seddighzadeh M, et al. Analysis of neuropeptide S receptor gene (NPSR1) polymorphism in rheumatoid arthritis[J]. PLoS One, 2010, 5 (2): e9315.

8 Robledo G, González-Gay MA, Fernández-Gutiérrez B, et al. NPSR1 gene is associated with reduced risk of rheumatoid arthritis[J]. J Rheumatol, 2012, 39 (6): 1166-1170.

9 朱紅艷，吳健民，崔天盆. 湖北漢族變應(yīng)性哮喘患者GPR154基因單倍型分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2007, 24 (1): 48-51.

10趙明哲，楊遠(yuǎn). 支氣管哮喘及焦慮與NPSR1基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2014, 37 (5): 365-367.

11D’Amato M, Bruce S, Bresso F, et al. Neuropeptide s receptor 1 gene polymorphism is associated with susceptibility to inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2007, 133 (3): 808-817.

12Anedda F, Zucchelli M, Schepis D, et al. Multiple poly-morphisms affect expression and function of the neuropeptide S receptor (NPSR1)[J]. PLoS One, 2011, 6 (12): e29523.

13中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組. 對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(2007年,濟(jì)南)[J]. 中華消化雜志, 2007, 27 (8): 545-550.

14王玉芳，歐陽欽，胡仁偉，等. 炎癥性腸病流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué), 2013, 18 (1): 48-51.

15Pape HC, Jüngling K, Seidenbecher T, et al. Neuropeptide S: a transmitter system in the brain regulating fear and anxiety[J]. Neuropharmacology, 2010, 58 (1): 29-34.

16Donner J, Haapakoski R, Ezer S, et al. Assessment of the neuropeptide S system in anxiety disorders[J]. Biol Psychiatry, 2010, 68 (5): 474-483.

17Roth AL, Marzola E, Rizzi A, et al. Structure-activity studies on neuropeptide S: identification of the amino acid residues crucial for receptor activation[J]. J Biol Chem, 2006, 281 (30): 20809-20816.

18Vendelin J, Pulkkinen V, Rehn M, et al. Characterization of GPRA, a novel G protein-coupled receptor related to asthma[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33 (3): 262-270.

19Pietras CO, Vendelin J, Anedda F, et al. The asthma candidate gene NPSR1 mediates isoform specific downstream signaling[J]. BMC Pulm Med, 2011, 11: 39.

20Pulkkinen V, Majuri ML, Wang G, et al. Neuropeptide S and G protein-coupled receptor 154 modulate macrophage immune responses[J]. Hum Mol Genet, 2006, 15 (10): 1667-1679.

21Sundman L, Saarialho-Kere U, Vendelin J, et al. Neuropeptide S receptor 1 expression in the intestine and skin -- putative role in peptide hormone secretion[J]. Neurogastroenterol Motil, 2010, 22 (1): 79-87, e30.

22Henstr?m M, Zucchelli M, S?derh?ll C, et al. NPSR1 polymorphisms influence recurrent abdominal pain in children: a population-based study[J]. Neurogastroenterol Motil, 2014, 26 (10): 1417-1425.

23Camilleri M, Carlson P, Zinsmeister AR, et al. Neuropeptide S receptor induces neuropeptide expression and associates with intermediate phenotypes of functional gastrointestinal disorders[J]. Gastroenterology, 2010, 138 (1): 98-107.e4.

24Bruce S, Nyberg F, Melén E, et al. The protective effect of farm animal exposure on childhood allergy is modified by NPSR1 polymorphisms[J]. J Med Genet, 2009, 46 (3): 159-167.

(2014-12-16收稿；2015-01-08修回)

Association of Neuropeptide S Receptor 1 Gene Polymorphisms with Inflammatory Bowel DiseaseLIUShi,WANGXiaobing,ZHOUFeng,WUTing,ZHOURui,LIUJing,XIABing.DepartmentofGastroenterology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan(430071)

Correspondence to: XIA Bing, Email: bingxia@aliyun.com

Background: Studies showed that neuropeptide S receptor 1 (NPSR1) gene polymorphisms were associated with the susceptibility of inflammatory bowel disease (IBD) in Europe’s populations, however, there is no study on the relevance in Chinese population. Aims: To investigate the association of NPSR1 gene polymorphisms with IBD in Chinese Han population. Methods: A total of 457 IBD patients [355 cases of ulcerative colitis (UC) and 102 cases of Crohn’s disease (CD)] from Zhongnan Hospital of Wuhan University and 500 healthy controls were recruited. Genotyping of 2 single nucleotide polymorphisms (SNPs) of NPSR1, rs323922 (C→G mutation) and rs740347 (G→C mutation) was performed by using PCR and sequencing techniques. Results: Differences of the frequencies of genotypes and alleles for rs323922 and rs740347 between UC, CD patients and controls didn’t reach statistical significance (P>0.05). Genotype-phenotype analysis showed that there were some impact of genotypes for rs323922 and rs740347 on clinical phenotypes of IBD: (i) For rs323922, mutant CG genotype was correlated with male CD patients (OR: 0.441, 95% CI: 0.230-0.844) and CD involving the colon (OR: 0.425, 95% CI: 0.199-0.911), and might be a protective factor. (ii) For rs740347, mutant CC genotype was correlated with early onset CD patients (<16 years old) (OR: 15.019, 95% CI: 2.634-86.470) and mutant C allele was correlated with CD involving the colon (OR: 2.142, 95% CI: 1.709-4.294), both were risk factors. Conclusions: Polymorphisms of NPSR1 rs323922 and rs740347 are not contributors of IBD susceptibility in Chinese Han population, but might be correlated with some clinical phenotypes of IBD.

Key wordsInflammatory Bowel Disease;Neuropeptide S Receptor 1;Polymorphism, Single Nucleotide;Genetic Predisposition to Disease;China

通信作者&本文，Email: bingxia@aliyun.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.04.003