尼克酰胺對(duì)急性肝功能衰竭小鼠的保護(hù)作用*

崔小蘭 李大偉 夏 強(qiáng)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科(200127)

急性肝功能衰竭(AHF)是多種因素作用引起的一組臨床綜合征，具有較高病死率。除肝移植外，目前尚無(wú)有效的治療方法，因此，早期干預(yù)AHF具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。尼克酰胺是一種水溶性B3組維生素，可從膳食中獲取，也可通過(guò)煙酸合成。內(nèi)源性尼克酰胺參與廣泛的生物代謝過(guò)程，包括能源合成和脂肪酸合成等［1］。多年來(lái)，尼克酰胺已被用于治療各種疾病，如糙皮病、銀屑病、精神分裂癥、Ⅰ型糖尿病等［2-4］。最近，諸多文獻(xiàn)報(bào)道尼克酰胺在體內(nèi)和體外均具有抗炎作用，可減少脂多糖(LPS)引起的炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6的釋放，以及對(duì)丙酸桿菌引起角化細(xì)胞趨化因子IL-8生成的抑制［5-7］。在內(nèi)毒素引起的肺部炎癥小鼠模型中，尼克酰胺明顯可降低肺部炎性細(xì)胞和炎癥因子水平。此外，尼克酰胺對(duì)心臟缺血再灌注損傷和腦創(chuàng)傷均有保護(hù)作用［8-9］。本文旨在研究尼克酰胺在AHF小鼠模型中是否也有抑制炎癥和保護(hù)的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性C57BL/6小鼠94只，8～12周，體質(zhì)量20～26 g，無(wú)固定病原體級(jí)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。晝夜規(guī)律光照，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。

2.儀器和試劑:D-半乳糖胺、LPS來(lái)源于大腸桿菌，尼克酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)公司;肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗Cleaved-Caspase-3抗體(1∶200稀釋)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

二、動(dòng)物分組以及AHF模型制備

1.基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):抽取54只小鼠按隨機(jī)表法分為6組，每組9只?？瞻讓?duì)照組小鼠未給予任何處理;尼克酰胺對(duì)照組小鼠腹腔注射尼克酰胺1000 mg/kg;將D-半乳糖胺700 mg/kg和 LPS 10 μg/kg溶解于0.2 mL 0.9%NaCl溶液后腹腔注射制備 AHF模型;尼克酰胺低、中、高劑量組小鼠分別腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg 1 h后制備AHF模型。

2.生存率實(shí)驗(yàn):將剩余40只小鼠隨機(jī)分為5組，每組各8只。AHF模型組建模方法同上文;0.9%NaCl溶液組:建模前 1 h腹腔注射 0.2 mL 0.9%NaCl溶液;尼克酰胺低、中、高劑量組:建模前1 h分別腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg。

三、檢測(cè)指標(biāo)

1.基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè):建模6 h后，6組小鼠腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置1 h后2000×g 4℃離心30 min，分離血清，測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。門靜脈灌注4%多聚甲醛固定小鼠肝組織，梯度濃度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，于光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。采用ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-6水平;采用TUNEL染色，熒光共聚焦顯微鏡下觀察肝細(xì)胞凋亡并拍照。留取部分肝組織提總蛋白，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Caspase-3表達(dá)。

2.生存率觀察:觀察5組小鼠于建模后72 h內(nèi)的死亡情況和死亡時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清轉(zhuǎn)氨酶水平

空白對(duì)照組ALT和AST水平與尼克酰胺對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AHF模型組ALT［(2799.00 ±384.35)U/L］和 AST［(3362.78 ±483.05)U/L］較兩個(gè)對(duì)照組明顯增高(P ＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組ALT和AST水平顯著降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)(圖1)。

二、肝組織病理學(xué)檢查

空白對(duì)照組和尼克酰胺對(duì)照組肝細(xì)胞呈條索狀排列，肝竇排列規(guī)則，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);AHF模型組肝細(xì)胞腫脹，肝竇嚴(yán)重淤血，可見(jiàn)片狀壞死和散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);與AHF模型組相比，尼克酰胺不同劑量組肝組織損傷減輕，肝細(xì)胞腫脹明顯減輕，肝竇淤血少見(jiàn)，未見(jiàn)壞死，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

三、血清炎癥因子水平

空白對(duì)照組TNF-α和IL-6水平與尼克酰胺對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);AHF模型組分別為(1408.67 ±139.84)pg/mL 和(3408.67 ±167.49)pg/mL，較兩個(gè)對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組TNF-α和IL-6水平均顯著降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P＜0.05)(圖3)。

圖1 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平

圖2 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)

圖3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平

四、肝細(xì)胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)情況

與空白對(duì)照組相比，尼克酰胺對(duì)照組肝細(xì)胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與兩個(gè)對(duì)照組相比，AHF模型組肝細(xì)胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組肝細(xì)胞凋亡和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)(圖4、5)。

五、小鼠生存情況

AHF模型組和0.9%NaCl溶液組8只小鼠于72 h內(nèi)均死亡，生存率為0%。尼克酰胺低、中、高劑量組72 h內(nèi)分別死亡5只、3只和0只小鼠，生存率分別為37.5%、62.5%和100%，較AHF模型組和0.9%NaCl溶液組明顯增加，死亡率明顯減少(P ＜0.05)(圖6)。

討 論

AHF的病理特點(diǎn)是肝細(xì)胞在短期內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，臨床特點(diǎn)是肝功能迅速惡化，引起肝性腦病、凝血功能障礙等急性并發(fā)癥，病情進(jìn)展迅速，死亡率高。D-半乳糖胺聯(lián)合LPS腹腔注射誘導(dǎo)AHF小鼠模型是研究急性肝損傷十分理想的動(dòng)物模型，有利于治療的評(píng)估和潛在致病機(jī)制的研究［10-12］。血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST是評(píng)價(jià)肝損傷的重要指標(biāo)，兩者水平高低可提示肝損傷的嚴(yán)重程度［13］。本研究顯示，尼克酰胺可顯著降低小鼠血清ALT和AST水平，對(duì)急性肝損傷有保護(hù)作用，肝組織病理結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這種保護(hù)作用。TNF-α是D-半乳糖胺聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中最主要的炎癥介質(zhì)，可引起炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致大量肝細(xì)胞凋亡和壞死［14-15］。有文獻(xiàn)［16］報(bào)道，抑制 TNF-α 的合成和釋放可減輕肝損傷。IL-6也是D-半乳糖胺聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中重要的炎癥因子，肝損傷后伴隨TNF-α和IL-6明顯升高［17-21］。目前認(rèn)為導(dǎo)致AHF的機(jī)制為D-半乳糖胺特異性地將肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷消耗殆盡，LPS引起肝臟Kupffer細(xì)胞高度活化，從而使其釋放大量活性介質(zhì)，如TNF-α和IL-6等，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞彌漫性壞死、凋亡，肝功能嚴(yán)重障礙甚至發(fā)生器官衰竭［22-24］。尼克酰胺是B族維生素成員，文獻(xiàn)報(bào)道尼克酰胺有明顯的抑制炎癥作用，可減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，明顯減輕肝細(xì)胞壞死和凋亡［25］。本研究通過(guò)預(yù)先腹腔注射不同劑量的尼克酰胺，觀察小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α和IL-6水平、肝臟病理?yè)p傷和生存率，旨在評(píng)價(jià)尼克酰胺對(duì)AHF的作用。結(jié)果顯示，尼克酰胺能明顯降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平和TNF-α、IL-6水平，肝組織病理?yè)p傷明顯減輕;尼克酰胺預(yù)處理能明顯降低肝組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，減少肝細(xì)胞凋亡，并明顯提高小鼠生存率。

圖4 各組肝細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

圖5 各組小鼠肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

圖6 各組小鼠生存率情況

綜上所述，尼克酰胺通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，減輕肝損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制肝細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)D-半乳糖胺聯(lián)合LPS引起的急性肝損傷，具有潛在的臨床治療作用。

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