龍眼胚性愈傷組織AGO6基因克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達(dá)分析

楊曼曼，林玉玲，王天池，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所/亞熱帶果樹研究所，福建福州350002)

龍眼胚性愈傷組織AGO6基因克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達(dá)分析

楊曼曼，林玉玲，王天池，賴鐘雄*

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所/亞熱帶果樹研究所，福建福州350002)

摘要：依據(jù)龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫Unigene序列，利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，獲得DlAGO6基因的cDNA全長序列，共3 168 bp(登錄號為KF819529)，完整開放閱讀框2 700 bp，編碼900個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明：DlAGO6的cDNA所編碼的氨基酸序列含有2個(gè)高度保守的PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，具有典型的AGO類蛋白的結(jié)構(gòu)特征；與擬南芥AGO6蛋白序列有較高的同源性。 龍眼體胚發(fā)生過程中DlAGO6表達(dá)量的qPCR分析表明： DlAGO6在龍眼松散型胚性愈傷組織時(shí)期的表達(dá)量最高，在魚雷形胚時(shí)期表達(dá)量最低，推測DLAGO6在龍眼松散型胚性愈傷組織階段的高表達(dá)量，可能與細(xì)胞的旺盛分裂有關(guān)。

關(guān)鍵詞：龍眼；體胚發(fā)生；AGO6;基因克隆；定量PCR

Argonaute蛋白(AGO)是在細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、植物以及動物中發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上高度保守的堿性蛋白，根據(jù)其功能結(jié)構(gòu)域可分為AGO亞族和PIWI亞族，目前在植物中所發(fā)現(xiàn)的AGO 蛋白都屬于AGO亞族[1]。擬南芥中的AGO6蛋白屬于AGO亞族，與siRNA介導(dǎo)的異染色質(zhì)的積累、DNA的甲基化以及基因沉默具重要的作用[2-3]。AGO蛋白含有保守結(jié)構(gòu)域 PIWI和PAZ，除此之外，還有包括N末端和Middle。其中 PAZ 結(jié)構(gòu)域在 Dicer 蛋白中也有，含有β亞結(jié)構(gòu)域能夠識別并結(jié)合sRNA的3端核苷酸，PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNaseH構(gòu)象并具備RNA內(nèi)切酶活性，在基因沉默過程中行使sRNA靶標(biāo)mRNA的切割作用，形成3′-OH和5′-磷酸酸基末端[4]。

AGO蛋白在基因沉默的過程中發(fā)揮著重要的功能，是構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的核心元件，參與靶向mRNA的斷裂、翻譯抑制或染色質(zhì)修飾[5]。AGO蛋白在與小RNA的共同作用下對于基因組的穩(wěn)定具有維持的作用，對組織發(fā)育具有調(diào)控作用，參與逆境脅迫響應(yīng)以及激發(fā)免疫防御[6]。該蛋白存在于所有高等真核生物，并在不同的胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)座子沉默等過程中具有重要作用。擬南芥中AGO蛋白含有10種，可分為3個(gè)分支，分別為AGO1/AGO5/AGO10、AGO2/AGO3/AGO7、AGO4/AGO6/AGO8/AGO9[7]，不同的AGO蛋白形成沉默復(fù)合體結(jié)合的小RNA有所差異，其中AGO6偏向于與長度為24nt并且5′端為腺嘌呤的小RNA結(jié)合形成沉默復(fù)合體[8]。

近年來隨著小RNA逐步成為研究熱點(diǎn)，與小RNA調(diào)控相關(guān)的Argonaute蛋白也成為了研究的焦點(diǎn)，然而關(guān)于Argonaute蛋白家族的研究主要集中在擬南芥和水稻等草本植物，在木本植物果樹中有關(guān)這類基因的研究卻鮮有報(bào)道，在本研究以龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，借助龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)，對龍眼胚性愈傷組織Argonaute(AGO)基因進(jìn)行克隆，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測其在體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，為將來研究AGO蛋白與小RNA代謝調(diào)控作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究以長期繼代保持且遺傳穩(wěn)定的“紅核子”品種龍眼(DimocarpuslonganLour.cv.Honghezi)胚性愈傷組織(LC2細(xì)胞系)為試驗(yàn)材料，由賴鐘雄[9]1994年誘導(dǎo)并由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長期進(jìn)行繼代保存。龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已在GenBank上登陸，登陸號為SRA059205。依據(jù)龍眼體胚發(fā)生同步化調(diào)控的方法[10]，獲得的龍眼體胚6個(gè)不同階段的胚性培養(yǎng)物的同步化材料，即松散型胚性愈傷組織、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚，將其作為目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析的試驗(yàn)材料。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取第一鏈cDNA的合成取龍眼體胚發(fā)生各階段的培養(yǎng)物0.2 g，采用TriPure提取法提取總的RNA(總RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol Reagent，參考試劑盒說明書提取)，用DNAaseⅠ處理除去基因組DNA，測OD確定RNA的質(zhì)量以及濃度，選取A260/A280在1.9～2.1的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR的cDNA合成采用的TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A)，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄分別合成6個(gè)時(shí)期的cDNA。

1.2.2AGO6轉(zhuǎn)錄組分析在龍眼胚性愈傷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索AGO6相關(guān)的基因，提取序列并在NCBI數(shù)據(jù)庫與其它物種進(jìn)行比對，以確定所選序列是同一條基因。

1.2.3引物設(shè)計(jì)根據(jù)龍眼體胚性愈傷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Unigene21308、Unigene29677、Unigene 33433、Unigene40534、Unigene49772、Unigene51602以及GenBack數(shù)據(jù)庫中植物AGO基因相關(guān)核酸序列信息，采用DNAMAN6 軟件設(shè)計(jì)克隆該基因的引物。同時(shí)根據(jù)所得的全長序列結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)熒光定量引物。本研究中使用的引物序列見表1，引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.4目的片段的擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板，AGO-F1和AGO-R1為上下游引物，進(jìn)行保守區(qū)域的RT-PCR擴(kuò)增，以AGO-F2和AGO-R2為引物進(jìn)行延伸的RT-PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

以3′RACE的cDNA為第一輪PCR擴(kuò)增的模板，AGO-3R1和3P為引物進(jìn)行第一輪的PCR擴(kuò)增，將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，AGO-3R2和3NP為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。

5′RACE采用的是由Invitrogen公司Gene RacerTM(RLM-RACE) kit，按照試劑盒說明書的步驟逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以AGO-5RACE1和5P為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。以第一輪產(chǎn)物稀釋100倍為模板，AGO-5RACE2和5NP為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，采用BIOMIGA公司DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD-18T載體后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆鑒定后送測序。

1.2.5生物信息學(xué)分析利用以下工具對龍眼AGO6基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析：利用ExPASy Protparam預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(http://www.expasy.ch/ tools/protparam.htmL)；SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和PSORT軟件(http://psort.nibb.ac.jp/)分別預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽及其斷裂位點(diǎn)與亞細(xì)胞定位情況；EMBnet TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html)預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段；NCBI-ProteinTools(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白質(zhì)的保守區(qū)域；Coils(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)預(yù)測蛋白質(zhì)曲螺旋結(jié)構(gòu)；磷酸位點(diǎn)預(yù)測使用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；Phyre2[11]軟件進(jìn)行預(yù)測二、三級結(jié)構(gòu)，采用MEGA5.0[12]軟件基于鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6qPCR的擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)參照Lin和Lai[13]的步驟進(jìn)行，Takara SYBR ExScript 試劑和羅氏LightCycler 480儀器，以龍眼體胚6個(gè)不同發(fā)育階段稀釋后的cDNA為模板，使用AGO-QF和AGO-QR上下游引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增.，反應(yīng)體系和反應(yīng)過程參照Lin和Lai[13]的實(shí)驗(yàn)，以6個(gè)不同模板的混合樣5倍梯度系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從擴(kuò)增曲線圖中得到各樣品的Ct值，從而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得不同階段AGO6基因的mRNA相對含量，并通過Lin和Lai[13]建立的多基因內(nèi)參體系的校正最終得到目的基因的相對表達(dá)量。

表1　基因克隆以及qPCR引物序列

2結(jié)果與分析

2.1龍眼胚性愈傷組織AGO基因cDNA全長序列的獲得

以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，AGO-F1和AGO-R1為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序得到目的條帶長度為1 858 bp，將該序列的核苷酸在GenBank上經(jīng)BLAST比對，與數(shù)據(jù)庫中已有的AGO的核苷酸序列同源性很高，以AGO-F2和AGO-R2為引物向3′端延伸獲得647 bp；以AGO-3R1和3P為第一輪擴(kuò)增引物，AGO-3R2和3NP為第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行3′RACEPCR擴(kuò)增獲得778 bp；以AGO-5RACE1和5P為第一輪擴(kuò)增引物，AGO-5RACE2和5NP為第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行5′RACEPCR擴(kuò)增獲得580 bp。

將測序所得序列采用DNAMAN6進(jìn)行拼接，得到AGO6基因cDNA的全長序列3 168 bp，并以AGO-F(C)和AGO-R(C)為引物進(jìn)行ORF驗(yàn)證，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA，開放閱讀框(ORF)長為2 700 bp，編碼900個(gè)氨基酸，與以AGO-F(C)和AGO-R(C)為引物PCR擴(kuò)增獲得的ORF一致；5′端非編碼區(qū)(5′UTR)長為145 bp和3′非編碼區(qū)(3′UTR)長為323 bp，含25個(gè)polyA。將該序列的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在GenBank上BLAST和BLASTn，結(jié)果顯示均與數(shù)據(jù)庫中已有的擬南芥的AGO6核苷酸和氨基酸序列高度同源，因此推測該基因?yàn)辇堁叟咝杂鷤M織的AGO6基因，該序列在GeneBank中登陸，命名為DlAGO6，登陸號為KF819529。

2.2龍眼胚性愈傷組織AGO序列及理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

利用生物信息學(xué)對龍眼胚性愈傷組織AGO6基因編碼的氨基酸的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。ExPASy ProtParam 推測：蛋白質(zhì)分子量為100.246 ku，分子式為C4426H7096N1262O1317S37，總原子數(shù)為14 138；由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)含量豐富分別占9.0%和8.7%，色氨酸含量最少0.6%，N端末端為蛋氨酸(Met)。該蛋白的Grand average of hydropathicity(GRAVY)值為 -0.341，理論等電點(diǎn)為9.21，不穩(wěn)定指數(shù)為38.55，故該蛋白是親水、穩(wěn)定的堿性蛋白。

利用TMpred工具，對AGO6蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果顯示，從第836個(gè)氨基酸到第857個(gè)氨基酸的之間有一個(gè)從內(nèi)向外的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，該跨膜螺旋得分為895；從第841個(gè)氨基酸到第859個(gè)氨基酸的之間也有一個(gè)從內(nèi)向外的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋得分為892，以上結(jié)果說明該蛋白為跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示該蛋白存在于微體(過氧化氫酶)和細(xì)胞核中的可能性較大。SignalP 4.1 Server在線分析顯示，不含有明顯信號肽，由此可得該蛋白是一個(gè)非分泌蛋白。

采用NCBI-ProteinTools對蛋白質(zhì)保守區(qū)域預(yù)測(圖1)，結(jié)果顯示該蛋白含有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，其中PAZ結(jié)構(gòu)域與AGO結(jié)合RNA有關(guān)，PIWI區(qū)域具有RNaseH酶的活性，對mRNA具有切割的作用。

圖1　DlAGO6蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1　Functional domains forecast for DLAGO6 protein

圖2　DlAGO6蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2　Three-dimensional structural prediction for DLAGO6 protein

使用phyre 2在線分析軟件分析蛋白的二三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白含有α-螺旋和β-鏈，其中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-鏈的含量分別占24%、28%和25%；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)整體近似一個(gè)球形(圖2)，其中也主要是α-螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲組成，它們相互纏繞。使用Coils對該蛋白質(zhì)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果表明該蛋白沒有曲螺旋結(jié)構(gòu)。

磷酸化位點(diǎn)預(yù)測顯示，該蛋白絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)最多，含29個(gè)，其次是蘇氨酸含13個(gè)，酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)最少為6個(gè)，該蛋白總共含有48個(gè)預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，分布較為均勻。絲氨酸磷酸化的主要作用是變構(gòu)蛋白質(zhì)以激活蛋白質(zhì)的活力，主要是指酶活力。而酪氨酸磷酸化除了在變構(gòu)以及激活該蛋白的活力之外，更重要的功能是結(jié)核蛋白提供一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，以促進(jìn)其和其他蛋白質(zhì)相互作用從而形成多蛋白復(fù)合體。AGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNA內(nèi)切酶活性，而該蛋白豐富的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，可能為增加該蛋白與小RNA結(jié)合能力起著一定的作用。

2.3龍眼胚性愈傷組織AGO6蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用MEGA5.05近鄰相接法(Neighbor-Joining，NJ)將DlAGO6編碼的氨基酸序列同擬南芥、水稻、葡萄的AGO家族的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(如圖3)，進(jìn)化樹中數(shù)字代表bootstrap值，重復(fù)檢測1 000次。由圖可以看出，進(jìn)化樹分為三個(gè)分支，這三個(gè)分支與擬南芥的三個(gè)亞族的歸屬吻合，分別是AG01、AG07和AG04亞族[14]。DlAGO6基因聚集于AGO4亞族中，且與擬南芥、水稻的同源基因AtAGO6、OsAGO6屬于一分支，由此可知，DlAGO6蛋白屬于AGO蛋白家族的AG04亞族。

圖3　DlAGO6與擬南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of DLAGO6，Arabidopsis,rice,and grapes AGO protein family

2.4AGO基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

采用在線軟件Funcoup3.0(http://funcoup.sbc.su.se/search/)[15]，以擬南芥作為參照模式植物，在Confidence threshold 0.2、Expansion depth 1、Nodes per expansion step 200的參數(shù)下，預(yù)測到AGO6(AT2G32940)可能的基因互作網(wǎng)絡(luò)圖如圖4所示，互作網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)基因如圖5所示。AGO6蛋白與AGO4(AT2G27040)、TUA4(AT5G11320)、TUB2(AT5G62690)、AT1G24360、AT5G09510、AT4G34555可能具有代謝上下游關(guān)系，與ULT1(AT4G28190)可能具有蛋白互作關(guān)系，與AT2G04390、HTB4(AT5G59910)、YUC4(AT1GO4820) 可能形成復(fù)合體物質(zhì)，由此可見，AGO6在相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用。

2.5龍眼體胚發(fā)生過程中AGO6基因的表達(dá)分析

MiRNA的負(fù)調(diào)控作用是通過與AGO蛋白誘導(dǎo)形成沉默復(fù)合體(RISC)進(jìn)行的，因此對AGO基因表達(dá)的分析有助于了解miRNA調(diào)控的機(jī)制。本研究選用了體胚發(fā)生過程6個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行qPCR，內(nèi)參基因采用EIF4α、EF-1α和FSD來校正數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在龍眼體胚發(fā)生不同時(shí)期該基因的表達(dá)水平變化活躍，在胚性愈傷時(shí)期的表達(dá)量最為豐富，是不完全胚性緊實(shí)時(shí)期的6倍左右；在球形胚發(fā)育到子葉形胚的過程中，在魚雷形胚時(shí)期表達(dá)量下降到最低點(diǎn)，其他時(shí)期的表達(dá)量相對穩(wěn)定，是不完全胚性緊實(shí)時(shí)期的3倍作用。說明DlAGO6在龍眼胚性發(fā)育過程中球形胚、心形胚、子葉形胚，尤其是胚性愈傷組織中起關(guān)鍵作用。DlAGO6在龍眼胚性愈傷時(shí)期大量表達(dá)，推測該階段miRNA 的調(diào)控作用活躍，miRNA的表達(dá)量較多。

圖4　AGO6的基因互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4　Gene interaction network map of AGO6

圖5　AGO6互作網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)基因Fig.5　Related gene of AGO6 gene interaction network map

1:松散型的胚性愈傷組織(Stage 1)；2:不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(Stage 2)；3:球形胚(Stage 3)；4:心形胚(Stage 4)；5:魚雷形胚(Stage 5)；6:子葉形胚(Stage 6)。1:The friable-embryogenic callus(Stage 1);2:Incomplete compact pro-embryogenic cultures(Stage 2);3:Globular embryos(Stage 3);4:Heart embryos(Stage 4);5:Topedo embryos(Stage 5);6:Cotyledonary embryos(Stage 6).EIF4α,EF-1α and FSD were as reference genes to balance the data of qRT-PCR.圖6　龍眼體胚發(fā)生過程中DlAGO6 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.6　Relative expressions of DlAGO6 at different stages of longan SE

3討論

3.1龍眼胚性愈傷組織AGO6蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

由于miRNA相關(guān)研究有所突破，與miRNA沉默途徑密切相關(guān)的AGO蛋白也逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，其在模式植物擬南芥和水稻中的研究相對深入，然而對于果樹中的AGO蛋白卻鮮見報(bào)道。本研究利用利用RACE和PCR技術(shù)，以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，克隆得到DlAGO6基因cDNA全長序列，核酸序列和氨基酸序的比對結(jié)果顯示同模式植物擬南芥的AGO6的核酸序列和蛋白質(zhì)序列同源性很高。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因編碼的氨基酸序列具有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，是AGO蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，是識別和結(jié)合小RNA的重要元件[16]。PIWI是AGO形成沉默復(fù)合體(RISC)后主要的切割元件，其中PIWI區(qū)域中的保守的氨基酸殘基為 2 個(gè)天冬氨酸和 1 個(gè)組氨酸(DDH)，同RNA酶H的DDE催化模體對應(yīng)[17]。Liu等[18]和 Rivas 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，人的AGO2的DDH突變株切割活性缺失，驗(yàn)證了這一推斷。AGO基因在模式植物擬南芥中研究相對全面，擬南芥中的10個(gè)AGO蛋白都含有切割所必須的DDH或DDD殘基。而對基因DlAGO6編碼的氨基酸保守功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因中含DDH結(jié)構(gòu)，由此推測龍眼AGO6基因具有切割mRNA功能，參與轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。

模式植物擬南芥AGO基因亞細(xì)胞定位研究顯示，AtAGO4主要位于細(xì)胞核和少量的核小體中，AtAGO6主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[19-20]，趙麗等[21]的研究結(jié)果顯示，AtAGO1、AtAGO2、AtAGO3、AtAGO4和，AtAGO9中含有核定位信號肽。本研究獲得的龍眼AGO6基因的亞細(xì)胞定位分析預(yù)測該蛋白存在微體(過氧化氫酶)和細(xì)胞核中的可能性較大。

3.2龍眼體胚發(fā)生過程中DLAGO6基因的差異表達(dá)

近期研究表明，小RNA與植物體胚發(fā)育密切相關(guān)，而小RNA與AGO蛋白形成沉默復(fù)合體對靶基因作用，從而推測AGO蛋白與體胚發(fā)育相關(guān)[22-24]。DlAGO6在龍眼體胚發(fā)生過程中不同時(shí)期的都有表達(dá)，相對表達(dá)量有所差異，說明它在龍眼體胚發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞在體胚發(fā)生早期細(xì)胞分裂較快，研究表明，AGO6：GUS只在擬南芥芽和根的生長點(diǎn)以及連接這些組織的生長點(diǎn)表達(dá)[8]，在本研究中，DLAGO6在龍眼胚性愈傷時(shí)期表達(dá)量高，分析其可能與細(xì)胞的分裂有關(guān)。AGO蛋白在植物體胚發(fā)生晚期，能夠抑制頂端分生組織中細(xì)胞的分化，從而保證了分生組織內(nèi)細(xì)胞的擴(kuò)增[25]。DLAGO6的在子葉胚時(shí)期的表達(dá)量有所上升，說明在DLAGO6可能具有以上功能。雖然本研究表明DLAGO6在龍眼體胚發(fā)生過程中有重要作用，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Cloning ofAGO6 from Embryogenic Callus and Its Expression Analysis

by qPCR during Somatic Embryogenesis inDimocarpuslonganLour.

YANG Man-man,LIN Yu-ling,WANG Tian-chi,LAI Zhong-xiong*

(Institute of Horticultural Biotechnology/Institute of Subtropical Fruit Trees,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract：Based on the database of longan transcriptome sequences,the DlAG06 from longan embryogenic callus was isolated by using RACE and PCR．The results showed that the cloned full—length cDNA sequence of DlAGO6 was 3 168 bp in length(Genbank：KF819529),containing a 2 700 bp open reading frame(ORF) encoding 900 amino acids.Bioinformatics predicted that the deduced DlAGO6 protein with two conserved PAZ and PIWI domains had the typical characteristics of the AGO family，which had a high identity with the known Arabidopsis thaliana AGO6 protein.The qPCR analysis indicated that the expression level of DlAGO6 gene was the lowest at the stage of torpedo embryo and reached the maximum at the stage of the friable-embryogenic callus，which suggested that DlAGO6 may be associated with exuberant cell division.

Key words:Dimocarpus longan;somatic embryogenesis;AGO6；gene clonging;qPCR

作者簡介：楊曼曼(1988—)，女，碩士生,主要從事果樹生物技術(shù)研究,E-mail:291194137@qq.com;* 通信作者：賴鐘雄，研究員，博導(dǎo)，E-mail:Laizx01@163.com。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272149、31201614)、福建省重大科技平臺建設(shè)項(xiàng)目(2008N2001)和福建省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(2012J05042)

收稿日期：2014-05-15修回日期：2014-06-23

中圖分類號：S667.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)01-0141-08