甘肅冬小麥品種(系)面筋強度、黃色素含量和PPO活性相關基因的分子檢測

周喜旺，宋建榮，岳維云，張耀輝，曹世勤，呂莉莉，劉鴻燕，

王娜1，南海1，趙尚文1

(1.甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅 天水　741000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州　730070)

甘肅冬小麥品種(系)面筋強度、黃色素含量和PPO活性相關基因的分子檢測

周喜旺1，宋建榮1，岳維云1，張耀輝1，曹世勤2，呂莉莉1，劉鴻燕1，

王娜1，南海1，趙尚文1

(1.甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅 天水741000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州730070)

摘要：為了明確甘肅冬小麥品種(系)中品質(zhì)相關基因的分布狀況，提高品質(zhì)育種效率，以141份小麥品種(系)為材料，利用高分子量麥谷蛋白亞基1Dx5的特異PCR標記、與黃色素含量相關的八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,Psy)基因Psy-A1的標記YP7A及多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性基因Ppo-A1的標記PPO18分別進行1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1的基因型檢測.結(jié)果表明：含1Dx5基因的材料56份，分布頻率為39.7%；Psy-A1位點存在Psy-A1a和Psy-A1b 2種等位變異類型，分布頻率分別為62.4%和37.6%；Ppo-A1位點存在Ppo-A1a和Ppo-A1b 2種等位變異類型，分布頻率分別為42.6%和57.4%.1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1的基因類型在不同地區(qū)分布頻率存在明顯差異，1Dx5和Psy-A1b基因在天水地區(qū)頻率最高，分別為51.0%和40.8%；Ppo-A1b基因在慶陽地區(qū)頻率最高，為77.8%，Psy-A1a基因在3地區(qū)的分布頻率明顯高于Psy-A1b基因.參試材料中，聚合1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因的材料有19份，這些材料可作親本資源，在小麥品種面筋強度和面粉色澤的改良中加以利用.

關鍵詞：普通小麥；1Dx5；黃色素；多酚氧化酶活性；分子檢測

第一作者：周喜旺(1978-)，女，助理研究員，研究方向為小麥遺傳育種.E-mail:zhouxiwang1208@163.com

Molecular detection of genes associated with gluten strength,

yellow pigment content and PPO activity of winter

wheat cultivars (lines) in Gansu Province

ZHOU Xi-wang1,SONG Jian-rong1,YUE Wei-yun1,ZHANG Yao-hui1,CAO Shi-qin2,

LYU Li-li1,LIU Hong-yan1,WANG Na1,NAN Hai1,ZHAO Shang-wen1

(1.Tianshui Institute of Agricultural Sciences,Tianshui 741000,China;2.Institute of Plant Protection,

Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In order to define the distribution of genes related to quality traits and improve breeding efficiency,3 gene specific markers for HMW-GS 1Dx5,Psy-A1 and Ppo-A1 genes were used to detect the allelic variations at these loci in 141 Gansu wheat cultivars and advanced lines.The results indicated that the frequency of 1Dx5 gene was 39.7%,the frequencies of Psy-A1a genotype with high yellow pigment content and Psy-A1b genotype with low yellow pigment content at Psy-A1 locus were 62.4% and 37.6%,respectively;the frequencies of Ppo-A1a genotype with high PPO activity and Ppo-A1b genotype with low PPO activity at Ppo-A1 locus were 42.6% and 57.4%,respectively.Significant differences among 1Dx5,Psy-A1 and Ppo-A1 were found in different areas,1Dx5 and Psy-A1b were distributed mainly in Tianshui area,with frequency of 51.0% and 40.8%,respectively;Ppo-A1b had highest frequency of 77.8% in Qingyang area.The frequency of Psy-A1a was obviously higher than that of Psy-A1b in three areas.19 materials contented desired gene for 1Dx5 and alleles for Psy-A1b and Ppo-A1b,thus it is essential to combine the desired genes in a variety to improve the processing quality of Gansu winter wheat.The markers used in this study were all gene-specific,with good stability and high accuracy,and they can be efficiently applied in molecular marker-assisted breeding for wheat quality improvement.

Key words：common wheat;1Dx5;yellow pigment;polyphenol oxidase activity;molecular detection

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，近年來，隨著人們生活水平的日益提高，消費者對小麥品質(zhì)提出了更高的要求，目前，國內(nèi)外已將品質(zhì)改良作為小麥育種的重要目標之一.

高分子量麥谷蛋白亞基對面團粘彈性有重要影響[1-2].Glu-D1位點等位基因1Dx5+1Dy10編碼的5+10亞基與高面筋強度密切相關，是所有高分子量麥谷蛋白亞基中對面包烘烤品質(zhì)貢獻最大的亞基[3].目前，Ovidio[4]等和Smith[5]等已分別開發(fā)了1Dx5和1Dy10位點特異的PCR標記，由于1Dx5和1Dy10緊密連鎖，可利用1Dx5基因的標記檢測來判斷5+10亞基的有無.黃色素是小麥籽粒中最重要的天然素，有研究報道小麥籽粒黃色素含量與面制食品的白度呈高度負相關[6]，與面團黃度的相關系數(shù)高達0.8～0.9[7].Miskelly等[8]研究表明，黃色素含量主要受基因型控制，遺傳力為0.68.Parker等[9]、Elouafi等[10]研究表明，黃色素含量受多個基因位點的調(diào)控，但位于第7同源群上的QTL效應最大.He等[11]克隆了位于小麥7A染色體上的基因Psy-A1，并開發(fā)出相應的功能標記YP7A，此標記能較好地區(qū)分7AL染色體上控制黃色素含量高、低的等位基因Psy-A1a和Psy-A1b.研究發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)催化的化學反應是引起面團或面條顏色變褐的主要原因[12]，從而影響面制品的外觀品質(zhì)和營養(yǎng)價值[13-14].面粉中PPO的含量雖僅占籽粒中總PPO含量的3%[15]，但可以解釋面制品顏色變異的50%～70%[16]，通過遺傳育種途徑選擇低PPO活性的小麥品種是改良小麥面制食品顏色變褐的主要措施.張立平等[17]發(fā)現(xiàn)染色體2AL和2DL上存在控制PPO活性的主效QTL，其貢獻率分別為37.9%～50.0%和25.0%～29.1%.Sun 等[18]開發(fā)出了位于2AL染色體上的功能標記PPO18.此標記能有效區(qū)分小麥2AL染色體上控制高、低PPO活性的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b.以上特異標記的開發(fā)，為小麥種質(zhì)資源及品種(系)中相關基因的快速、準確檢測提供了可能.

目前，國內(nèi)學者利用上述標記，并取得了較好的研究結(jié)果.但以甘肅冬小麥品種(系)為試驗材料進行品質(zhì)性狀方面檢測尚未見報道.基于此，作者選用部分甘肅冬小麥品種(系)進行品質(zhì)性狀相關基因的分子檢測，旨在明確研究材料所含的基因種類及其相關品質(zhì)狀況，篩選有價值的小麥種質(zhì)，為小麥品質(zhì)育種提供親本材料；并進一步驗證相關標記的有效性和實用性，以期利用分子標記輔助選擇技術加快小麥品質(zhì)改良的步伐.

1材料與方法

1.1供試材料

試驗所用141份小麥品種和育成新品系的名稱和來源見附表1，由甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學研究所小麥中心提供.每份材料選取籽粒飽滿種子，播種于直徑9 cm的黑色營養(yǎng)缽內(nèi)，2葉1心期采集新鮮葉片用于基因組DNA的提取.

1.2基因組DNA的提取

參考文獻[19-20]用CTAB法提取小麥基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及濃度，并稀釋到50 ng/μL.

1.3特異性分子標記

1Dx5的特異PCR標記及YP7A、PPO18標記的引物序列及相關信息見表2，所用引物由北京賽百盛公司合成.

1.4PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴增及凝膠電泳所用試劑均購于北京天根生化科技公司.1Dx5、YP7A和PPO18標記的PCR反應體系均為10 μL，其中2 μL ddH2O、5 μL 2×MasterMix、上下游引物各1 μL、模板DNA(50 ng/μL)1 μL.3個標記的擴增程序分別參照表1相關文獻，略有改動.1Dx5的擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.YP7A的擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PPO18的擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.擴增產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用緩沖體系為1×TBE溶液，電壓180 V，擴增產(chǎn)物電泳1 h，銀染顯色后，置于白熾燈箱上用數(shù)碼相機拍照.

表1　甘肅141份小麥品種(系)品質(zhì)性狀相關基因分子檢測結(jié)果

“+”表示檢測到1Dx5基因，“-”：表示未檢測到1Dx5基因； YP7A檢測到194 bp片段，以“1”表示，231 bp片段，以“2”表示；PPO18檢測到685 bp片段，以“1”表示，876 bp片段，以“2”表示.

表2　用于檢測品質(zhì)性狀相關基因的分子標記及其引物序列

2結(jié)果與分析

2.11Dx5基因檢測結(jié)果

1Dx5基因的特異PCR標記是顯性標記，含該基因的材料，可擴增得到450 bp的特異片段，不含1Dx5基因的材料，無此片段.從圖1可以看出，利用PCR標記，在電泳圖譜450 bp的位置上，可明顯區(qū)分供試材料中1Dx5基因的有無.在141份材料中，有56份材料含有該基因，占參試材料的39.7%.

M:分子量標準;1:‘天選43號’;2:‘天選45號’;3:‘天選46號’;4:‘中梁12號’;5:‘蘭天7號’;6:‘ 蘭天23號’;7:‘中梁14號’;8:‘蘭天24號’;9：‘西峰25號’;10:‘天S98531’.

圖11Dx5基因特異PCR標記對部分材料的擴增結(jié)果

Fig.1PCR amplification in partial varieties with

1Dx5 specific PCR marker

2.2Psy-A1位點的等位變異

采用共顯性標記YP7A，對供試材料Psy-A1位點的等位基因Psy-A1a和Psy-A1b進行檢測(圖2)，分別擴增得到194 bp和231 bp大小的片段.在141份材料中，含Psy-A1a等位基因的材料有88份，占62.4%；含Psy-A1b等位基因的材料有53份，占37.6%.表明甘肅省冬小麥品種(系)的Psy-A1位點上廣泛存在Psy-A1a和Psy-A1b2種等位變異類型.

M:分子量標準;1:‘中梁27號’;2:‘天選43號’;3:‘中梁14號’;4:‘中梁23號’;5:‘天選46號’;6:‘隴鑒9811’;7:‘蘭天9號’;8:‘ 蘭天11號’;9:‘天S98531’;10:‘蘭天7號’.

圖2利用YP7A檢測部分材料中的Psy-A1等位變異

Fig.2Identification of Psy-A1 locus in partial

varieties with YP7A

2.3Ppo-A1位點的等位變異

利用共顯性標記PPO18，對供試材料Ppo-A1位點的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b進行檢測(圖3)，分別擴增得到685 bp和876 bp大小的片段.在141份材料中，含Ppo-A1a等位基因的材料有60份，占42.6%；含Ppo-A1b等位基因的材料有81份，占57.4%.表明甘肅省冬小麥品種(系)的Ppo-A1位點上廣泛存在Ppo-A1a和Ppo-A1b2種等位變異類型.

M:M:分子量標準;1:‘中梁12號’;2:‘中梁23號’;3:‘中梁14號’;4:‘天選46號’;5:‘蘭天2號’;6:‘蘭天3號’;7:‘蘭天25號’;8:‘隴原011’;9:‘西峰25號’.

圖3利用PPO18檢測部分材料中的Ppo-A1等位變異

Fig.3Identification ofPpo-A1 locus in partial

varieties withPPO18

2.4聚合優(yōu)異基因材料的篩選

在所有參試材料中，既含有低黃色素含量等位基因Psy-A1b，又含有低多酚氧化酶活性等位基因Ppo-A1b，同時含有1Dx5基因的材料有19份(‘天選43’‘天選45’‘天選48’‘天選49’‘天03-165-2’‘天S98531’‘S98530-7-2-2-1-1-1’‘03-165-6-1’‘01-61-4-2-1-1-1’‘S98531-1-1-1-2’‘99211-1-1-4-1’‘9474-1-1-5-2-1-2c2’‘05495-34-5-1-4’‘0817-4’‘0741-1-14’‘05184-1-1-4’‘08531-15’‘96289’‘99293’)，說明甘肅冬小麥品種(系)中，聚合多個優(yōu)良品質(zhì)性狀基因的品種(系)不是很多，小麥品質(zhì)改良工作急需加強.

2.5不同地區(qū)1Dx5、Psy-A1及Ppo-A1基因類型分布

從表3可以看出，1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1基因在不同地區(qū)分布頻率存在明顯差異，1Dx5和Psy-A1b基因主要分布在天水地區(qū)，頻率分別為51.0%和40.8%，Psy-A1a基因在3個地區(qū)的分布頻率明顯高于Psy-A1b基因；Ppo-A1a基因在蘭州地區(qū)分布頻率最高，為55.9%，Ppo-A1b基因在慶陽地區(qū)分布頻率最高，為77.8%.

表2　不同地區(qū)被測基因等位變異分布頻率

3討論與結(jié)論

基因功能標記的開發(fā)與應用是小麥分子育種的重要方向[21].基于PCR技術，本研究檢測的141份材料中，發(fā)現(xiàn)1Dx5基因的分布頻率為39.7%，與王靜等[22]、徐相波等[23]的研究結(jié)果16.3%和34.7%基本一致，但遠低于國外的基因頻率(約85%)[24]，這也與目前甘肅省冬小麥育種中僅重視抗條銹育種，尚不重視品質(zhì)育種有很大關系.研究發(fā)現(xiàn)，本試驗中低黃色素含量等位基因Psy-A1b的分布頻率為37.6%，與楊芳萍等[21]研究的國內(nèi)主要冬麥區(qū)的歷史品種和當前主栽品種、胡鳳靈等[25]研究的中國不同地區(qū)的221份小麥品種中Psy-A1b分布頻率分別為37.8%和36.6%的結(jié)果基本一致，表明甘肅乃至中國大部分冬小麥品種(系)的黃色素含量高，不符合中國傳統(tǒng)食品饅頭、面條的白度要求，降低小麥品種黃色素含量是小麥品質(zhì)育種的重要目標.多酚氧化酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等位基因Ppo-A1b的分布頻率為57.4%，略高于全國平均水平(52%)[15]，高于張春利等[26]對黑龍江省小麥品種的研究結(jié)果(41.2%)，略低于肖永貴等[27]對中國冬小麥品種的檢測結(jié)果(58.2%)，表明盡管甘肅省冬小麥在品質(zhì)育種方面沒有針對Ppo-A1基因進行定向選擇，但Ppo-A1b的分布頻率不是很低，選擇潛力大，有利于培育符合甘肅傳統(tǒng)食品面條、饅頭所需的低多酚氧化酶活性的品種，提高甘肅小麥面粉的白度.

通過對甘肅省141份冬小麥品種(系)1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因等位變異分析，各基因在不同地區(qū)分布頻率存在明顯差異.1Dx5、Psy-A1b基因主要分布在天水地區(qū)，Ppo-A1b基因在慶陽地區(qū)分布頻率最高，這可能與各地區(qū)所用親本及育種方向不同有關.綜合來看，供試材料中，聚合有1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因的品種(系)有19份，且全為甘肅天水地區(qū)材料，在甘肅蘭州和慶陽地區(qū)的材料中未檢測到聚合3個基因的品種(系)，今后小麥品質(zhì)育種要以聚合多個優(yōu)良品質(zhì)性狀基因為重點，同時借助分子標記技術加快小麥品質(zhì)改良的步伐.

由于小麥籽粒黃色素含量和多酚氧化酶活性分別受多個基因位點的調(diào)控，僅考慮某一位點的基因型并不能準確評價真實的黃色素含量和多酚氧化酶活性.本研究對甘肅冬小麥品種(系)從Psy-A1和Ppo-A1位點初步進行了基因型鑒定，下一步要做的工作應該是對黃色素含量和多酚氧化酶活性的另外位點進行基因型鑒定及不同位點基因組合方式做深入研究.

[1]Payne P I.Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread making quality[J].Annual Review of Plant Physiology,1987,38:141-153

[2]Payne P I,Nightingale M A,Krattiger A F,et al.The relationship between HMW-glutenin subunit composition and the bread-making quality of British-grown wheat varieties[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1987,40(1):51-65

[3]Nakamura H.Identification of alleles for complex gene loci Glu-A1,Glu-B1,and Glu-D1,which code for high molecular weight subunits of glutenin in Japanese hexaploid wheat varieties[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,47(12):5273-5277

[4]D'Ovidio R,Anderson O D.PCR analysis to distinguish between alleles of a member of a multigene family correlated with wheat bread-making quality[J].Theoretical and Applied Genetics,1994,88(6-7):759-763

[5]Smith R L,Schweder M E,Barnett R D.Identification of glutenin alleles in wheat and triticale using PCR-generated DNA markers[J].Crop Science,1994,34(5):1373-1378

[6]Kruger J E,Matsuo R R,Preston K.A comparison of methods for the prediction of Cantonese noodle colour[J].Canadian Journal of Plant Science,1992,72(4):1021-1029

[7]Symons S J.Computer analysis of fluorescence for the measurement of flour refinement as determined by flour ash content,flour grade colour,and tristimulus colour measurements[J].Cereal Chemistry,1991,68:454-460

[8]Miskelly D M.Flour components affecting paste and noodle colour[J].Journal of Science of Food and Agriculture,1984,35(4):463-471

[9]Parker G D,Chalmers K J,Rathjen A J,et al.Mapping Loci Associated with Flour Color in Wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,1998,97:238-245

[10]Elouafi I,Nachit M M,Martin L M.Identification of a microsatellite on chromosome 7B showing a strong linkage with yellow pigment in durum wheat(TriticumturgidumL.var.durum)[J].Hereditas,2001,135(2-3):255-261

[11]He X Y,Zhang Y L,He Z H,et al.Characterization of phytoene synthase 1 gene (Psy1 ) located on common wheat chromosome 7A and development of a functional marker[J].Theoretical and Applied Genetics,2008,116(2):213-221

[12]Simeone R,Pasqualone A,Clodoveo M L,et al.Genetic mapping of polyphenol oxidase in tetraploid wheat[J].Cellular and Molecular Biology Letters,2002,7(2B):763-769

[13]Fuerst E P,Anderson J V,Morris C F.Delineating the role of polyphenol oxidase in the darkening of alkaline wheat noodles[J].Journal of Agricultural andFood Chemistry,2006,54(6):2378-2384

[14]陳鋒,左愛輝,崔黨群.小麥籽粒多酚氧化酶及其控制基因研究進展[J].麥類作物學報,2011,31(4):780-797

[15]Anderson J V,Morris C F.An improved whole-seed assay for screening wheat germplasm for polyphenol oxidase activity[J].Crop Science,2001,41(6):1697-1705

[16]Kruger J E,Hatcher D W,Depauw R.A whole seed assay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulness as a measure of noodle darkening[J].Cereal Chemistry,1994,71(4):324-326

[17]張立平,葛秀秀,何中虎,等.普通小麥多酚氧化酶活性的QTL分析[J].作物學報,2005,31(1):7-10

[18]Sun D J,He Z H,Xia X C,et al.A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat[J].Molecular Breeding,2005,16(3):209-218

[19]Andrew H P,Curt L B,Jonathan F W,A rapid method for extraction of cotton(Gossypiumspp.) genomic DNA suitable for RFLP for PCR analysis[J].Plant Molecular Biology Reporter,1993,11(2):122-127

[20]黃冰雪,李唯,姜寒玉,等.抗旱性小麥基因組DNA的提取及RAPD反應體系優(yōu)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報,2009,44(1):55-59

[21]楊芳萍,何心堯,何中虎,等.中國小麥品種黃色素含量基因等位變異分子檢測及其分布規(guī)律研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2008,41 (10):2923-2930

[22]王靜,劉東濤,馮國華,等.黃淮麥區(qū)部分小麥品種(系)1Dx5+1Dy10的分子檢測與分析[J].中國農(nóng)學通報,2010,26(6):31-34

[23]徐相波,劉冬成,郭小麗,等.小麥谷蛋白亞基 1Dx5的分子鑒定及標記輔助選擇[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2005,38(2):415-419

[24]張學勇,董玉琛,游光俠,等.中國小麥大面積推廣品種及骨干親本的高分子量谷蛋白亞基組成分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2001,34(4):355-362

[25]胡鳳靈,何中虎,葛建貴,等.小麥品種黃色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子標記檢測[J].麥類作物學報,2011,31(1):47-53

[26]張春利,何心堯,宋慶杰,等.多酚氧化酶活性基因在黑龍江小麥品種中的分布[J].麥類作物學報,2008,28(5):759-765

[27]肖永貴,何心堯,劉建軍,等.中國冬小麥品種多酚氧化酶活性基因等位變異檢測及其分布規(guī)律研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2008,41(4):954-960

(責任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-24；修回日期：2014-06-11

基金項目：國家自然科學基金項目(31160362)；甘肅省生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2010-24).

通信作者：宋建榮，男，研究員，研究方向為小麥遺傳育種.E-mail:tskd228202@163.com

中圖分類號：S 512.1+1

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)02-0054-07