蜂斗菜素誘導(dǎo)骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞凋亡及其機制

岳海源，任冬青，王東萍，雷栓虎，齊 進(jìn)，汪玉良

（1．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病重點實驗室，甘肅蘭州 730030；2．甘肅省人民醫(yī)院麻醉科，甘肅蘭州 730000；3．甘肅省人民醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，盡管對骨髓瘤的生物學(xué)研究和臨床治療技術(shù)有了較大進(jìn)展，但對MM的臨床治療仍是醫(yī)學(xué)界一大難題。蜂斗菜素是藥食兩用植物蜂斗菜的提取物，研究表明蜂斗素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤活性［1-2］。蜂斗菜素是否能抑制骨髓瘤，通過何種途徑起作用目前尚未見報道。為尋求新的能有效治療MM的藥物，我們采用骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞，研究了蜂斗菜素的抗MM作用及其相關(guān)的分子機制，以期為蜂斗菜素應(yīng)用于臨床抗骨髓瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞系 骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，實驗前從液氮中取出培養(yǎng)。

1．2 藥品試劑 蜂斗菜素（含量≥98%，批號：20130321，西安天瑞生物技術(shù)有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基，臺盼藍(lán)染色檢測試劑盒，Caspase抑制劑Z-VAD-FMK購自碧云天生物研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，Hoechst 33258染色液購自武漢博士德生物制品有限公司；p-ERK，p-MEK，p-p38抗體（鼠抗人）均購自美國 CST公司；Caspase-3、8、9（鼠抗人）抗體購自美國Santa Cruz公司。

1．3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國SIM公司）；CJ-2F超凈工作臺（蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司）；尼康80i熒光顯微鏡（日本尼康）；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）

1．4 方法

1．4．1 細(xì)胞培養(yǎng) 骨髓瘤 RPMI 8226細(xì)胞用含100 mL／L胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、50mL／L CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)方法消化、傳代。處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1．4．2 錐蟲藍(lán)拒染法檢測蜂斗菜素對 RPMI 8226細(xì)胞的增殖抑制作用 實驗分為加藥組和對照組。取對數(shù)期細(xì)胞，重懸于新鮮培養(yǎng)基中，調(diào)整合適濃度，接種于12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24h。參考文獻(xiàn)［2］，加藥組蜂斗菜素終濃度設(shè)定為1、5、10、20、40μmol／L，對照組加入同體積新鮮的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72h。收集細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染色3min左右，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，計算抑制率。每個濃度設(shè)復(fù)孔3個，所有實驗均重復(fù)3次。

1．4．3 TUNEL法檢測蜂斗菜素對 RPMI 8226細(xì)胞凋亡的影響 實驗分組及細(xì)胞接種同1．4．2。給予終濃度分別為5、10、20μmol／L的蜂斗菜素后，繼續(xù)孵育24、48、72h。以2．5g／L的胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1 000r／s離心5min，收集細(xì)胞，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1．4．4 Hochest 33258熒光染色法觀察細(xì)胞核的變化 實驗分對照組、加藥組、抑制劑組。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整合適細(xì)胞濃度接種于12孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h后，棄舊培養(yǎng)基，加藥組給予含5、10、20μmol／L蜂斗菜素的新鮮培養(yǎng)基；抑制劑組以10μmol／L caspase 抑 制 劑 Z-VAD-FMK 預(yù) 作 用30min，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后，處理同加藥組；對照組給予新鮮的空白培養(yǎng)基。各組細(xì)胞繼續(xù)孵育72h，收集細(xì)胞，根據(jù)Hochest 33258熒光染色說明書操作，并采用熒光顯微鏡觀察。

1．4．5 Western blot檢測 實驗分組同1．4．2。取對數(shù)期生長細(xì)胞，調(diào)整合適細(xì)胞濃度接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h后，棄舊培養(yǎng)基，加藥組給予含5、10、20μmol／L蜂斗菜素的新鮮培養(yǎng)基，對照組給予新鮮的空白培養(yǎng)基。各組細(xì)胞繼續(xù)孵育72h，收集細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)的含量。Western blot實驗時，規(guī)定上樣量為20～40μg，一抗（1∶1 000，鼠抗人 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、p-MEK、p-ERK1／2、p-p38抗體）4℃過夜，加入二抗（1∶1 000，辣根過氧化物酶標(biāo)記）于恒溫30℃孵育2h，ECL顯色法進(jìn)行檢測，應(yīng)用Image pro plus V7．0軟件分析條帶的積分吸光度。

2 結(jié) 果

2．1 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞的增殖抑制作用將不同濃度的蜂斗菜素（1、5、10、20、40μmol／L）作用于RPMI 8226細(xì)胞24、48、72h后，隨時間的延長和濃度的增加，蜂斗菜素對細(xì)胞的抑制率逐漸增加，蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞的增殖抑制作用具有時間和濃度依賴性（P均＜0．05）。分別作用24、48、72h后蜂斗菜素處理組細(xì)胞與空白對照組細(xì)胞抑制率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0．01）。蜂斗菜素作用24、48、72h的IC50值分別是21．47、14．29、9．23μmol／L（表1）。

2．2 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞凋亡率的影響將不同濃度的蜂斗菜素（5、10、20μmol／L）作用于RP-MI 8226細(xì)胞24、48、72h后，隨時間的延長和濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，蜂斗菜素誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞凋亡具有時間和濃度依賴性（P均＜0．05）。各時段蜂斗菜素處理組細(xì)胞與空白對照組細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0．01，表2）。

表1 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞增殖的影響Tab．1 Effects of p on the proliferation of RPMI 8226cells（±s，n＝3）

表1 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞增殖的影響Tab．1 Effects of p on the proliferation of RPMI 8226cells（±s，n＝3）

與對照組比較，＊P＜0．05，＃P＜0．01。

組別 抑制率（%）24h 48h 72h對照組000蜂斗菜素組1μmol／L 11．25±3．31 19．91±8．14 27．29±3．56＊5μmol／L 23．68±7．17＃ 28．86±5．16＃ 32．15±9．01＃10μmol／L 38．10±9．06＃ 42．57±14．36＃ 49．50±8．98＃20μmol／L 50．62±14．63＃ 57．62±13．68＃ 62．93±17．14＃40μmol／L 59．96±11．85＃ 66．54±21．03＃ 72．36±16．23＃

2．3 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)的影響 將不同濃度的蜂斗菜素（5、10、20μmol／L）作用于RPMI 8226細(xì)胞72h后，與對照組比較，隨藥物濃度增加，細(xì)胞核碎裂濃縮程度增加，藍(lán)色熒光增強，出現(xiàn)大量凋亡小體，表明蜂斗菜素濃度依賴性地誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡，驗證了TUNEL法檢測結(jié)果（圖1）。給予Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)作用30min后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡受到明顯抑制，提示蜂斗菜素誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞凋亡可能是通過Caspase激活來介導(dǎo)的。

表2 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞凋亡率的影響Tab．2 Effects of petasin on the apoptosis rate of RPMI 8226 cells（±s，n＝3）

表2 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞凋亡率的影響Tab．2 Effects of petasin on the apoptosis rate of RPMI 8226 cells（±s，n＝3）

與對照組比較，＃P＜0．01，△P＜0．001。

組別 凋亡率（%）24h 48h 72h對照組4．89±1．74 7．56±2．17 10．63±1．86蜂斗菜素組5μmol／L 11．30±1．47＃ 21．40±2．20＃ 30．87±2．33＃10μmol／L 21．19±1．73＃ 34．18±2．469＃ 40．85±1．69＃20μmol／L 33．72±1．08△ 43．06±2．43△ 51．72±2．72△

圖1 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig．1 Effects of petasin on the morphology of RPMI 8226cell nuclei（×200）

2．4 蜂斗菜素對RPMI 8226細(xì)胞Caspase蛋白和MEK／ERK、p38MAPK蛋白磷酸化水平的影響 10～20μmol／L蜂斗菜素作用72h后，與對照組相比，Caspase-3、8、9蛋白表達(dá)顯著性增加（P＜0．05，P＜0．01，P＜0．05），其中低濃度蜂斗菜素（5μmol／L）能明顯增加Caspase-8蛋白的表達(dá)（P＜0．05），證實蜂斗菜素誘導(dǎo)的RPM I8226細(xì)胞凋亡是通過Caspase激活來介導(dǎo)的（圖2）。10～20μmol／L蜂斗菜素作用72h后，ERK1／2及MEK蛋白磷酸化水平顯著下降（P＜0．01，P＜0．05），p38MAPK蛋白磷酸化水平顯著上升（P＜0．01），提示 MAPKs參與了蜂斗菜素誘導(dǎo)的 RPMI 8226細(xì)胞凋亡（圖3）。

3 討 論

蜂斗菜素是藥食兩用植物蜂斗菜的提取物，在抗炎、抗過敏及治療偏頭痛領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，蜂斗菜酯類提取物具有潛在的抗癌活性［4-5］。硫蜂斗菜素可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡［6］；也有報道顯示蜂斗菜素具有顯著的抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖作用［2］。本研究結(jié)果顯示，蜂斗菜素對骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，能夠誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蜂斗菜素能夠激活Caspase蛋白并能夠改變MEK／ERK及p38MAPK磷酸化水平。

圖2 蜂斗菜素對Caspase-3、8、9蛋白表達(dá)的影響Fig．2 Effects of petasin on Caspase 3，8and 9protein expressions（±s，n＝3）

Caspase是半胱氨酸家族蛋白酶，廣泛參與細(xì)胞凋亡過程［7］。Caspase的活化是有順序的多步水解的過程。基本機制有兩種，即同源活化和異源活化。發(fā)生同源活化的Caspase，包括Caspase-8、9、10，開啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過異源活化方式水解下游Caspase，將凋亡信號放大，同時將死亡信號向下傳遞。被異源活化的Caspase，包括Caspase-3、6、7，執(zhí)行死亡程序［8-9］。因此，干預(yù)Caspase家族促凋亡相關(guān)蛋白可以成為腫瘤治療的靶點［10］。本研究結(jié)果表明，蜂斗菜素作用后，Caspase-3、8、9蛋白表達(dá)顯著增加。為了進(jìn)一步證實Caspase蛋白參與蜂斗菜素誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞凋亡，本研究采用Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)作用后，發(fā)現(xiàn)Z-VAD-FMK能夠明顯抑制蜂斗菜素誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞存活率下降，同時細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。這就提示蜂斗菜素誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞凋亡可能是通過Caspase激活來介導(dǎo)的。

圖3 蜂斗菜素對MEK／ERK、p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig．3 Effects of petasin on MEK／ERK and p38MAPK protein expressions（±s，n＝3）

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程的重要信號通路，分為ERK1／2通路、p38MAPK 通路等5個亞家族［11］，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟遵循 MAPKs的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，即 Ras／Raf／MEK／ERK途徑［12］。大量研究顯示，在MAPK通路中，ERK的磷酸化激活與MM細(xì)胞增殖有關(guān)［13-14］。但是，MAPK通路的p38和JNK通路的激活則可以促進(jìn) MM細(xì)胞調(diào)亡［15-16］。程月芳等［2］證明，蜂斗菜素抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的分子機制是下調(diào)ERK1／2蛋白的磷酸化水平。本實驗發(fā)現(xiàn)，10～20μmol／L蜂斗菜素72h后，能顯著下調(diào)ERK1／2及MEK蛋白磷酸化水平，同時我們發(fā)現(xiàn)蜂斗菜素能顯著上調(diào)p38MAPK蛋白磷酸化水平，這與其他人的報道是一致的。提示蜂斗菜素的作用機制可能是通過影響MEK／ERK及p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮的。

總之，蜂斗菜素對骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，能夠誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，其分子機制可能是通過活化Caspase蛋白從而開啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，放大凋亡信號，并將死亡信號向下傳遞，同時改變MEK／ERK及p38MAPK磷酸化水平，影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，蜂斗菜素作為來源于蔬菜類的化合物，其低毒特點更為其應(yīng)用于臨床骨髓瘤的治療提供了優(yōu)勢。

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